苜蓿干旱誘導(dǎo)相關(guān)基因的克隆和功能分析.pdf

1、本試驗(yàn)以公農(nóng)三號(hào)根蘗型苜蓿為試驗(yàn)材料。經(jīng)過(guò)溫室條件下盆栽試驗(yàn)和人為干旱條件的施加，用mRNA差異顯示技術(shù)分析干旱脅迫下苜?；虮磉_(dá)與正常供給水分的苜蓿基因表達(dá)的差異片斷。通過(guò)斑點(diǎn)雜交技術(shù)篩選得到的基因片斷，得到差異片斷后對(duì)其進(jìn)行序列測(cè)定和分析等研究，得到以下結(jié)果： 1、由于苜蓿具有扦插易成活的特性，在溫室條件并且水分溫度控制適當(dāng)?shù)那闆r下，無(wú)性扦插苜蓿的成活率可以達(dá)到90％。故利用盆栽和無(wú)性繁殖得到同一株系的植株，采用不同的處理和

2、梯度來(lái)進(jìn)行脅迫，并用分子生物學(xué)的方法進(jìn)行分析，是對(duì)苜蓿進(jìn)行基因表達(dá)研究一項(xiàng)可行的方案。這種方案比較對(duì)同一植株在逆境施加前后分別取樣來(lái)進(jìn)行分析比較，尤其是當(dāng)脅迫處理需要較長(zhǎng)時(shí)間的時(shí)候或者試驗(yàn)對(duì)象生命周期比較短的情況下，可以有效地降低由于生育階段改變而造成的假陽(yáng)性。 2、苜蓿在進(jìn)行一段時(shí)間的干旱脅迫后，會(huì)出現(xiàn)基因的差異表達(dá)。在對(duì)苜蓿進(jìn)行半個(gè)月的萎蔫-復(fù)原脅迫。誘導(dǎo)苜?；蛑械目购祷虮磉_(dá)。通過(guò)RNA的提取和mRNA差異顯示技術(shù)篩選一

3、共得到苜蓿的差異表達(dá)片斷32條。干旱脅迫誘導(dǎo)了公農(nóng)三號(hào)根蘗型苜?？鼓鏅C(jī)制的表達(dá)。 3、建立苜蓿基因差異表達(dá)研究體系。理論上，通過(guò)簡(jiǎn)并的3條錨定引物和8條隨機(jī)引物，即能夠覆蓋所有的mRNA，擴(kuò)增出所有的mRNA片斷，本試驗(yàn)利用3條錨定引物和10條隨機(jī)引物組合，通過(guò)DDRT-PCR方法研究正常和干旱脅迫下苜蓿的基因差異表達(dá)。并通過(guò)Reverse Northern雜交技術(shù)有效地篩選和排除DDRT-PCR技術(shù)得到的真、假陽(yáng)性片斷。