苜蓿中華根瘤菌042BMnoeAB基因的克隆、表達調控和功能分析.pdf

1、采用三親本雜交方法,將帶有Tn5-1063(含luxAB)的質粒pRL1063a導入苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)042BM,進行轉座子插入誘變,篩選到3個結瘤突變株042BMR5、042BMR11和042BRM29.它們都表現發(fā)光酶活性,表明轉座子正向插入到基因組中的某個啟動子下游.對042BMR5突變株的基因組進行反向PCR,擴增位于Tn5-1063兩端的側翼序列.測序結果表明,該轉座子插入到noeB

2、基因內.根據基因組中noeB上游和下游序列擴增出042BM noeB,其與苜蓿中華根瘤菌1021noeB的同源性為98﹪,而與NoeB蛋白的氨基酸序列相似性為95﹪.疏水性分析發(fā)現,NoeB是一個跨膜蛋白,在N末端有4個跨膜區(qū),其中包含3個初級螺旋和1個次級螺旋.通過PCR擴增,獲得了042BM的noeA基因.該基因與苜蓿中華根瘤菌1021noeA的同源性為99﹪,而與NoeA的相似性為97﹪.發(fā)現NoeA與中慢生根瘤菌(Mesorhi

3、zobium sp.)BNC1可能的SAM-依賴性的甲基轉移酶相似性為32﹪,而其303-362區(qū)域與大腸桿菌(Escherichia coli)的核糖體50S亞基的L11蛋白甲基轉移酶(PrmA)的160-220結構域的相似性達到41﹪.由此推測,NoeA對結瘤固氮作用的影響可能與基對L11蛋白的翻譯后甲基化修飾有關.通過插入卡那盒,敲除noeA.與苜蓿中華根瘤菌042BM相比,敲除noeA的突變株042BMA-Km在普通紫花、保定、

4、寧夏、百發(fā)和傲漢苜蓿品種上的結瘤數、根瘤鮮重和植株地上部分的干重都有不同程度的增加,而在秘魯苜蓿品種上的結瘤數和植株地上部分的干重明顯下降,在皇后和美國雜花苜蓿品種上則沒有明顯的變化.該基因對苜蓿的結瘤固氮能力表現出明顯的品種特異性.對noeAB基因進行的表達調控研究發(fā)現,葫蘆巴堿不能使noeAB的表達水平提高,證明它們的轉錄不受nodD2的調控.nodD3和syrM同時存在時,noeAB的表達水平沒有明顯的變化,表明它們也不受nodD

5、3-syrM系統(tǒng)的調控.毛地黃黃酮的誘導使noeAB基因的表達水平提高16倍,而在不添加毛地黃黃酮的TY培養(yǎng)基上,noeAB基因的表達水平也能夠提高30倍以上,說明noeAB是受nodD1控制的,但除受毛地黃黃酮誘導外,還可能受到其他因子的調節(jié).對042BM-Km進行的蛋白質組初步分析發(fā)現,noeA基因的敲除對蛋白質合成水平具有多效性影響.引起至少15個蛋白質合成水平發(fā)生了上調,啟動了至少28個新增蛋白的合成.另外,有一個蛋白點的合成發(fā)