玉米花期干旱脅迫下誘導(dǎo)基因的分離和功能分析.pdf

1、玉米是全球重要的糧、飼兼用作物，也是重要的能源作物，在糧食安全、能源安全等方面起著非常重要的作用。隨著全球性水資源的匱乏和玉米種植面積的不斷擴(kuò)大，干早愈加成為玉米生產(chǎn)的發(fā)展的限制因素。我國(guó)有一半以上的玉米受到干旱的威脅，尤其是在玉米花期，干旱脅迫往往會(huì)造成敗育和嚴(yán)重減產(chǎn)。但是，由于對(duì)玉米抗旱機(jī)制，特別是對(duì)其開(kāi)花期抗早的遺傳機(jī)制、對(duì)干旱脅迫的效應(yīng)研究較少，極大地限制著在育種手段與育種材料方面取得突破。本研究以抗旱性強(qiáng)的玉米自交系CN165

2、作為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)采用抑制差減雜交(SSH)方法構(gòu)建cDNA文庫(kù)，分離玉米雌穗和花絲干早脅迫下差異表達(dá)的基因，建立玉米花期干旱脅迫下雌穗和花絲誘導(dǎo)基因表達(dá)譜，解析玉米花期抗旱的分子機(jī)理，旨在為玉米抗旱育種及相關(guān)研究奠定新的理論內(nèi)容。 本研究構(gòu)建的cDNA文庫(kù)包含1920個(gè)陽(yáng)性克隆，經(jīng)過(guò)PCR驗(yàn)證后測(cè)序發(fā)現(xiàn)，1439條EST是有效序列，聚類(lèi)分析得到361條uniESTs，BLASTX分析表明，有218條uniESTs和數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋

3、白序列有較高的相似性。99條uniESTs和數(shù)據(jù)庫(kù)中的核酸序列有較高的相似性，但是找不到匹配的蛋白序列，還有44條uniESTs在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中既沒(méi)有相似的核酸序列也沒(méi)有相似的蛋白序列。218個(gè)已知功能的基因按照擬南芥功能基因組分類(lèi)的方法可以分為13類(lèi)，其中，與代謝相關(guān)的基因占27％，與蛋白質(zhì)合成相關(guān)的基因占16％，與蛋白質(zhì)加工相關(guān)的基因占10％，與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的基因占10％，與細(xì)胞發(fā)育周期相關(guān)的基因占9％。 采用cDNA

4、Macroarray的方法對(duì)獲得的uniESTs進(jìn)行分析，結(jié)果表明：160個(gè)uniESTs個(gè)在雌穗中是上調(diào)表達(dá)的，129個(gè)uniESTs在花絲中是上調(diào)表達(dá)的，125個(gè)uniESTs在雌穗和花絲都是上調(diào)表達(dá)的。為了驗(yàn)證cDNA MacroarTay結(jié)果的可靠性，采用實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time quantitativePCR)方法對(duì)cDNA文庫(kù)中的10個(gè)uniESTs進(jìn)行了分析，結(jié)果表明兩種方法獲得的基因表達(dá)量是不完全一致的，但基因

5、的表達(dá)模式相同，說(shuō)明利用cDNAMacroaiTay對(duì)cDNA文庫(kù)中分離到的基因進(jìn)行表達(dá)譜的分析是可行的。 在這個(gè)cDNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)和來(lái)源于水稻與擬南芥ERD4基因相似性很高的uniEST，這個(gè)uniEST在干旱脅迫下的雌穗和花絲中都上調(diào)表達(dá)的。采用5’-RACE和3’-RACE的方法得到了這個(gè)uniEST的cDNA全長(zhǎng)，命名為ZmERD4。ZmERD4包含2073個(gè)bp，其中1776bp的開(kāi)放閱讀框，8bp的5'-UTR

6、和289 bp的3'-LITR。Southern blot結(jié)果表明ZmERD4在玉米基因組中含有一個(gè)拷貝。RNA gel blot結(jié)果表明ZmERD4受干旱脅迫、高鹽脅迫和ABA的誘導(dǎo)表達(dá)，但是不受低溫(4℃)脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明ZmERD4在細(xì)胞核中特異表達(dá)；ZmERD4編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示它是包含1個(gè)信號(hào)肽和7個(gè)跨膜區(qū)的整合膜蛋白；ZmERD4推導(dǎo)的氨基酸序列共具有8個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(Protein kinas

7、e C phosphorylation site)，14個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)(Casein kinaseⅡphosphorylation site)和3個(gè)十四烷基化位點(diǎn)(N-myristoylation site)。由于蛋白激酶C和酪蛋白激酶Ⅱ在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面有重要的作用，因此推斷．ZmERD4可能在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面受蛋白激酶C和酪蛋白激酶Ⅱ的調(diào)控；在逆境脅迫下，N-terminal myristoylation在膜靶和