水稻維管束發(fā)育相關基因AVB基因的圖位克隆和功能分析.pdf

1、水稻是世界上最重要的糧食作物之一，也是研究植物功能基因的模式作物。水稻的株型研究一直是水稻育種的重點。水稻的地上部位均是由莖端分生組織發(fā)育而來，在圓頂形SAM的周邊區(qū)域，部分干細胞分化形成側生器官原基，由側生器官原基進一步發(fā)育成熟器官的過程一般可分為細胞分裂和細胞伸長兩個階段，但這兩個階段并沒有明顯界限。側生器官原基的細胞分裂速度直接決定了最終的細胞數(shù)目，在決定器官大小方面起著重要作用。在側生器官原基發(fā)育為成熟器官的過程中，原形成層細胞

2、在特定的位置上不斷分化并最終形成維管系統(tǒng)。植物的維管系統(tǒng)連通從根部到地上部分的整個植物體，長途運輸營養(yǎng)物質和水分并為植物體提供機械支撐。
　　但由于目前對調控側生器官原基的分化和細胞分裂速率的分子機制了解并不深入，需要更多的研究以深化理解。在本研究中，首先我們證明了AVB基因參與維持側生器官原基正常的細胞分裂過程，其次我們證明了AVB基因參與生長素誘導的原形成層細胞的分化過程，最后我們發(fā)現(xiàn)AVB基因影響原形成層細胞的細胞分裂過程。

3、具體的研究結果如下：
　　1. avb突變體表型觀察
　　相比于野生型縉恢10號，avb突變體最明顯的特征是整個營養(yǎng)生長階段葉片變窄，并且隨著生長的繼續(xù)，葉片變窄的程度逐漸加深。除了葉片變窄外，在成熟期測量各節(jié)間的直徑發(fā)現(xiàn)相比于野生型，突變體的各節(jié)間直徑也明顯減少了。除了葉片和莖稈變窄，成熟期突變體的穗部也明顯表小了，穗莖軸變窄，一次枝梗和二次枝梗數(shù)目減少。相比于地上部分器官的寬度明顯減小，突變體的葉片長度及各節(jié)間的長度并沒

4、有發(fā)生明顯變化。
　　2. avb突變體組織學分析
　　為了探明造成 avb突變體地上部分器官變窄的原因，對野生型和突變體的各個器官進行組織切片，觀察發(fā)現(xiàn)相比于野生型，突變體葉片、葉鞘、莖稈、穗莖軸橫切面上的細胞總數(shù)顯著減少，且大小維管束的數(shù)目減少，在葉鞘、莖稈和穗莖軸部位還觀察到大小維管束的面積明顯增大，相鄰維管束之間的細胞數(shù)目增多。同時發(fā)現(xiàn)相比于野生型，突變體地下根部，一次枝梗和二次枝梗橫切面上細胞總數(shù)和維管束均無明顯變

5、化。
　　3. AVB基因遺傳分析和分子定位
　　利用日本晴與avb突變體進行雜交，發(fā)現(xiàn)F1代植株均表現(xiàn)正常，表明突變性狀是受隱性基因控制的；F2代群體出現(xiàn)性狀分離，有正常群體和窄葉群體兩組，正常單株：窄葉單株符合3:1的分離比，表明突變性狀受1對隱性核基因控制。以日本晴與avb突變體雜交的F2代窄葉單株作為定位群體，利用SSR和InDel標記進行AVB基因的定位，最終將AVB基因定位在第3染色體長臂標記SF2和SR3之間，

6、物理距離46Kb。
　　4. AVB候選基因克隆和轉基因驗證
　　對定位區(qū)間內的8個注釋基因的DNA片段進行測序，最終發(fā)現(xiàn)編碼一個未知功能蛋白的基因Os03g0308200的蛋白編碼區(qū)域發(fā)生了單堿基的改變，由C堿基變?yōu)?T堿基，對應的密碼子由精氨酸密碼子突變?yōu)榻K止密碼子，因此我們初步推測Os03g0308200基因是AVB基因的候選基因。為了驗證候選基因Os03g0308200就是我們要尋找的AVB基因，我們構建了包含Os0

7、3g0308200基因全長序列的互補載體和包含部分cDNA片段的干涉載體，把互補載體轉入avb突變體中發(fā)現(xiàn)突變表型完全恢復，把干涉載體轉入中花11的轉基因植株中的Os03g0308200基因表達量明顯下調，且葉片明顯變窄且維管束數(shù)目減少，這說明Os03g0308200基因就是AVB基因。
　　5. AVB基因的表達模式分析
　　利用定量PCR分析AVB基因在水稻植株中的表達情況，使用水稻ACTIN4作為內參，以AVB基因在幼

8、穗中的表達水平作為標準，發(fā)現(xiàn)AVB基因在莖尖生長點部位表達水平最高。利用原位雜交觀察 AVB基因在過莖尖縱切面上的信號發(fā)現(xiàn)AVB基因信號主要集中在莖尖部位，說明AVB基因的主要表達位點是莖尖部位。為了進一步分析AVB基因在莖尖部位的表達情況，我們仔細分析了過水稻頂端分生組織的橫切和縱切上AVB基因的信號分布情況，發(fā)現(xiàn)AVB基因的表達主要集中在頂端分生組織的葉原基啟動部位和葉原基，隨著葉原基的分化發(fā)育，AVB基因的表達集中在原形成層細胞中

9、。在成熟葉片中，AVB基因的表達均勻分布在整個維管束，沒有韌皮部和木質部特異性。
　　6. AVB基因參與生長素誘導的原形成層分化過程
　　考慮到生長素信號在原形成層分化中的作用，且在 avb突變體的葉原基發(fā)育過程中，發(fā)現(xiàn)原形成層分化數(shù)目減少，我們推測AVB基因可能與生長素之間有關系，為此我們使用活性生長素IAA和生長素極性運輸抑制劑TIBA處理縉恢10號，發(fā)現(xiàn)在用TIBA處理兩小時后，莖尖生長點部位的AVB基因的表達量明顯

10、上調。并且我們在AVB基因的啟動子上發(fā)現(xiàn)了3個典型的生長素反應元件，這3個生長素響應元件分別用羅馬數(shù)字Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ表示，體外凝膠阻滯實驗顯示生長素響應因子的DNA結合結構域可以與這3個生長素響應元件結合，以離起始密碼子最近的Ⅲ號元件的結合能力最強，因此我們推測AVB基因可能通過啟動子上的生長素響應元件參與葉片發(fā)育過程中生長素誘導的原形成層分化過程。
　　7. AVB基因的蛋白功能分析
　　AVB蛋白含有988個氨基酸殘基。根據(jù)

11、Phytozome網站上提供的信息，水稻中AVB家族蛋白共有5個。雖然NCBI網站上提供的注釋信息認為AVB蛋白是功能未知且沒有保守結構域，但根據(jù)全球蛋白質資源數(shù)據(jù)庫提供的信息，AVB蛋白屬于Armadillo-type fold蛋白家族，ARM類折疊（Armadillo-type fold）是由兩層α螺旋組成的右手超螺旋結構，一般用于介導蛋白質之間的相互作用。對AVB的同源蛋白進行系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)AVB在陸生植物界是保守的，且功能都

12、沒有過報道。
　　為了進一步獲得水稻植株內AVB蛋白產物的分布情況，我們采用western blot分析了在水稻植株的不同部位，AVB蛋白的存在情況，結果發(fā)現(xiàn)AVB蛋白質只存在于莖尖生長點部位且avb突變體中AVB蛋白完全缺失。AVB蛋白的亞細胞定位結果顯示AVB蛋白產物定位于細胞質和細胞核中。
　　考慮到avb突變體地上器官橫切面上細胞數(shù)目減少，我們推測avb突變體的細胞分裂過程可能受到了AVB蛋白缺失的影響。采用流式細胞

13、儀分析野生型和突變體生長點部位細胞的染色體倍性，發(fā)現(xiàn)突變體生長點細胞的四倍體比例明顯低于野生型的，這說明相對于野生型，突變體處于S期的細胞數(shù)目明顯減少，細胞分裂過程確實受到了AVB蛋白缺失的影響。histone H4作為染色體的組成成分，特異地在處于G1-S期的細胞中表達，采用原位雜交考察野生型和突變體過SAM橫切面上histone H4基因的表達情況進一步證明了AVB蛋白維持著生長點區(qū)域干細胞細胞分裂的正常進行。不同于葉原基部位his

14、tone H4基因表達頻率降低，在幼嫩葉鞘的原形成層細胞中，histone H4基因的表達頻率明顯增高，暗示相對于野生型，突變體原形成層細胞具有更強的細胞分裂能力，這也解釋了為什么在突變體中，維管束面積增大。
　　8. avb突變體的轉錄組分析
　　為了獲得由AVB基因突變所造成的突變體轉錄組水平上的變化情況，在分蘗后期，提取野生型和avb突變體的莖尖生長點部位的總RNA進行RNA-Seq，每個材料設置了3個獨立的生物學重復

15、。通過RNA-Seq共篩選到730個在野生型和突變體中差異表達的基因，其中678個基因在avb突變體中表達上調，52個基因下調。使用AgriGo網站對篩選到的差異基因進行gene ontology（GO）富集分析。GO富集結果顯示參與多細胞器官發(fā)育過程（GO：0007275）的基因受到AVB基因突變的強烈影響：水稻中參與這一過程的基因共有45個，其中44個基因的表達水平都發(fā)生了不同程度的改變：36個基因的表達明顯上調，8個基因的表達水平