馬尾松SSR引物開(kāi)發(fā).pdf

1、本文利用馬尾松富集文庫(kù)來(lái)開(kāi)發(fā)SSR引物。采用高效的微衛(wèi)星篩選分離策略：將基因組DNA 酶切，再進(jìn)行選擇性擴(kuò)增(AFLP DNA)；然后用生物素標(biāo)記的 (AG)<,15>、(AC)<,15>混合探針與其雜交，雜交后的片段與包被在磁珠表面的鏈親和素 (streptavidin)結(jié)合，經(jīng)過(guò)一系列洗滌后，不含SSR部分被洗滌，而含有SSR的AFLP片段通過(guò)PCR擴(kuò)增得到雙鏈目的片段，將這些片段連接到T載體上，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)PCR法檢測(cè)，最

2、后對(duì)58個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，向GENEBANK提交了27條非同源性序列。利用SSIHunter對(duì)序列進(jìn)行微衛(wèi)星統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)含有微衛(wèi)星序列13個(gè)。分析微衛(wèi)星種類，其中 (TG/AG)n、(GA/CT)n比例最高，并發(fā)現(xiàn)三堿基重復(fù)微衛(wèi)星(AAG)n、(CTT)n、(AAG)n。 利用生物信息學(xué)的方法，對(duì)火炬松數(shù)據(jù)庫(kù)中的1000條EST序列進(jìn)行了微衛(wèi)星篩選，結(jié)果得到50條含有微衛(wèi)星序列的EST序列。 利用軟件Primer5.0，對(duì)從

3、馬尾松富集文庫(kù)中得到的13個(gè)微衛(wèi)星序列和篩選出來(lái)的EST序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。用馬尾松7個(gè)個(gè)體進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，結(jié)果表明：其中有17對(duì)引物多態(tài)性較好。篩選出來(lái)的引物，進(jìn)一步在黑松5個(gè)個(gè)體和雪松5個(gè)個(gè)體中進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明,M1和M15在黑松中成功擴(kuò)增，表現(xiàn)出多態(tài)性；M1,M6和M14在雪松中成功擴(kuò)增，表現(xiàn)出多態(tài)性。本實(shí)驗(yàn)方法開(kāi)發(fā)微衛(wèi)星引物的效率較高?？勺鳛閺鸟R尾松基因組中分離微衛(wèi)星DNA的有效方法。 首次采用磁珠富集馬尾松AFLP片