不同基因型玉米幼苗對(duì)低磷脅迫的適應(yīng)機(jī)理.pdf

1、玉米是工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要的作物之一，土壤中有效磷不足限制了玉米的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)。然而，在通過(guò)大量施用磷肥提高土壤中的有效磷含量以增加產(chǎn)量的同時(shí)，卻帶來(lái)了磷礦資源的浪費(fèi)以及環(huán)境污染問(wèn)題。目前，科學(xué)的方法是從基因表達(dá)及調(diào)控的角度探索玉米的耐低磷機(jī)制，發(fā)掘耐低磷關(guān)鍵基因，并通過(guò)對(duì)玉米品種的分子改良，提高玉米對(duì)土壤磷的利用效率，同時(shí)實(shí)現(xiàn)低投入穩(wěn)產(chǎn)出。本文以耐低磷基因型玉米品種(DSY-2)和低磷敏感基因型玉米品種(DSY-79)為材料，研究了低磷脅迫

2、對(duì)供試玉米幼苗葉片葉綠素含量、根系POD酶活性、根系可溶性蛋白含量的影響，同時(shí)應(yīng)用基因芯片技術(shù)，分析了根系中基因表達(dá)對(duì)低磷脅迫的差異應(yīng)答，并結(jié)合酶活性測(cè)定和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)對(duì)部分候選基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了驗(yàn)證分析。主要結(jié)果如下:
　　1)低磷脅迫影響玉米幼苗葉片葉綠素含量
　　與對(duì)照組相比，低磷處理8天后，兩個(gè)供試玉米品種倒一葉中葉綠素a、b及總?cè)~綠素含量均有不同程度的下降，且低磷敏感型玉米品種DSY-

3、79倒一葉中葉綠素含量的下降更為顯著;同時(shí)，低磷處理8天后，耐低磷品種倒五葉中綠素含量與對(duì)照無(wú)顯著差異，但低磷敏感型品種較對(duì)照顯著下降。這表明，在缺磷條件下，低磷敏感玉米型幼苗由于不能獲得足夠的P元素，而需大量動(dòng)用老葉中的P元素以保證新葉的正常生長(zhǎng)。這也表明，低磷處理第8天已經(jīng)明顯影響玉米地上部的性狀，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇低磷處理8天后的玉米幼苗根系進(jìn)行基因差異表達(dá)分析。
　　2)低磷脅迫影響玉米根系POD活性及根系可溶性蛋白含量

4、r>　　對(duì)玉米幼苗根系POD活性的測(cè)定結(jié)果表明，低磷處理8天后，耐低磷基因型品種DSY-2和低磷敏感型品種DSY-79根系中POD活性均較對(duì)照有一定程度的增高，且耐低磷品種DSY-2根系中POD活性的增高更明顯。其原因可能是耐低磷品種DSY-2根系中抗氧化酶的表達(dá)能更主動(dòng)地應(yīng)答低磷脅迫，這和基因芯片及qRT-PCR所檢測(cè)到的有關(guān)低磷處理能導(dǎo)致耐低磷品種DSY-2根系中過(guò)氧化物酶基因表達(dá)明顯上調(diào)的結(jié)果相一致。這說(shuō)明在低磷條件下，耐低磷玉米

5、幼苗能通過(guò)POD的大量產(chǎn)生來(lái)保持體內(nèi)自由基的動(dòng)態(tài)平衡，以維持正常的生理生化穩(wěn)態(tài)。對(duì)玉米幼苗根系蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果表明，低磷脅迫導(dǎo)致耐低磷品種DSY-2根系中可溶性蛋白含量較對(duì)照有一定程度的增高，而低磷敏感品種DSY-79根系中的可溶性蛋白含量處理和對(duì)照間沒(méi)有明顯差異，這表明耐低磷品種幼苗在低磷脅迫下可能誘導(dǎo)了差異蛋白的表達(dá)。
　　3)低磷脅迫影響玉米根系耐低磷相關(guān)基因的表達(dá)水平
　　基因芯片的檢測(cè)結(jié)果顯示，在低磷脅迫處理8天

6、后，低磷敏感型品種DSY-79根系中相對(duì)于對(duì)照的有效差異表達(dá)（信號(hào)比=處理組轉(zhuǎn)錄信號(hào)值/對(duì)照組的轉(zhuǎn)錄信號(hào)，且信號(hào)比≤0.5或者≥2可確定為差異表達(dá)基因）基因共有102個(gè)，其中，上調(diào)基因36個(gè)，下調(diào)基因66個(gè);而耐低磷品種DSY-2根系中的有效差異表達(dá)基因高達(dá)336個(gè)，其中，上調(diào)基因251個(gè)，下調(diào)基因85個(gè)。然后，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道、差異表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄水平和生物信息學(xué)分析，篩選出了27個(gè)可能的耐低磷關(guān)鍵基因，分別屬于磷素吸收、動(dòng)員與能量代謝相關(guān)

7、基因;物質(zhì)代謝相關(guān)基因;細(xì)胞生長(zhǎng)與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)相關(guān)基因;轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子相關(guān)基因;物質(zhì)運(yùn)輸與基因轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因;脅迫響應(yīng)與防御相關(guān)基因等。進(jìn)一步利用熒光定量PCR檢測(cè)了這些基因在經(jīng)低磷處理8天后的玉米根系中的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明，對(duì)于耐低磷品種DSY-2根系，在根據(jù)基因芯片結(jié)果所選取出的20個(gè)上調(diào)表達(dá)基因中有17個(gè)經(jīng)qRT-PCR檢測(cè)也表現(xiàn)為明顯上調(diào)，其中，無(wú)機(jī)磷轉(zhuǎn)運(yùn)因子(inorganic phosphate transporter3)和β膨

8、脹素(expB7)基因受低磷脅迫的誘導(dǎo)程度尤為顯著，且過(guò)氧化物酶(peroxidase72)、酸性磷酸酶(acidphosphatase)、植物抗逆相關(guān)(endochitinase PR4)、茉莉酸合成相關(guān)(12-oxo-phytodienoic acidreductase)基因均表現(xiàn)為顯著的表達(dá)上調(diào)。而低磷敏感型品種DSY-79根系中僅有6個(gè)基因表現(xiàn)出了明顯的表達(dá)上調(diào)，同樣，DSY-79根系中無(wú)機(jī)磷轉(zhuǎn)運(yùn)因子(inorganic pho

9、sphatetransporter3)和β膨脹素(expB7)基因的表達(dá)受低磷脅迫誘導(dǎo)程度也非常顯著。
　　此外，經(jīng)低磷脅迫處理后，兩個(gè)品種玉米根系中的休眠相關(guān)基因（ARP）和泛素類蛋白(ubiqultin-like proteins)相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著下調(diào)，且耐低磷品種DSY-2的下調(diào)程度更高，且一些假想蛋白基因編碼基因經(jīng)qRT-PCR驗(yàn)證也表現(xiàn)出了顯著的表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，關(guān)于這些基因的差異表達(dá)在玉米耐低磷中所起的作用，還有待

10、于進(jìn)一步研究。
　　上述研究結(jié)果證實(shí)，磷素吸收、動(dòng)員與能量代謝、物質(zhì)代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)物質(zhì)合成、轉(zhuǎn)錄調(diào)控與因子、物質(zhì)運(yùn)輸與基因轉(zhuǎn)運(yùn)、脅迫響應(yīng)與防御等相關(guān)基因在低磷脅迫下的差異表達(dá)，在玉米耐低磷脅迫中都起著重要的作用。
　　4)玉米根系分泌蛋白的分離與純化
　　長(zhǎng)期以來(lái)根系分泌蛋白的研究因其分泌量少，混雜在根系分泌物中難以收集等原因而進(jìn)展緩慢，且在保證充足的光照使作物正常生長(zhǎng)的前提下，如何保持幼苗的無(wú)菌培養(yǎng)是目前