NR2A亞單位胞內C末端區(qū)對NMDA受體裝配、運輸以及表面表達的影響.pdf

1、NMDA受體是由NR1和NR2亞單位組成的異聚體復合物，亞單位之間的裝配對于NMDA受體通道的形成和表面表達至關重要。以往的研究提示，NR2亞單位胞內C末端區(qū)可能參與調節(jié)NMDA受體的表面表達和突觸定位。 本研究的第一部分通過一系列C末端截短的NR2A亞單位突變體的構建以及NMDA受體膜表面表達和功能的檢測，在HEK293細胞和培養(yǎng)海馬神經元研究了NR2A亞單位的C末端在NMDA受體裝配和表面表達中的作用。結果發(fā)現，當NR2A亞

2、單位的C末端截短后其TM4下游分別剩下59、5、3個氨基酸殘基時(2A△59、2A△5和2A△3)，它們均能與NR1-1a形成有功能的受體通道并表達于細胞膜表面，但是與未截短的NR2A相比其表面表達均有所下降；并且，當2A△5的TM4下游僅存的5個氨基酸EHLFY突變成EAAAA(2A△5EAAAA)時，仍可與NR1-1a形成受體復合物并表達于細胞膜表面。若將NR2A的C末端截短僅保留TM4后的1個氨基酸時(2A△1)，該突變體與NR1

3、-1a共轉染時，就不再獲得受體復合物的細胞膜表面表達，也不能記錄到谷氨酸誘發(fā)的電流。有趣的是，當NR1-4a與2A△1共轉染時，NR1-4a/2A△1受體復合物仍然能表達于HEK293細胞表面，并能檢測到通道功能。在此，與NR1-1a不同的是NR1-4a不含有內質網滯留基序列。以上結果提示，NR2A亞單位TM4后的3個氨基酸是NR1-1a/NR2A受體復合物細胞膜表面表達所必需的，然而，NR2A亞單位的C末端并不是NR2A與NR1裝配和

4、形成功能性通道所必需的，但能幫助NR1-1a克服內質網滯留作用使NMDA受體復合物表達于細胞膜表面。 本研究的第二部分研究了NR2A亞單位單獨轉染時膜表面表達。以往研究表明，在異源細胞單獨轉染NR2A亞單位不能獲得細胞膜表面表達，也不能檢測到有功能的受體通道，NR2A必須與NR1形成異聚體，才能形成有功能的受體通道。我們用GFP-NR2A單獨轉染HEK293細胞，經200nMPMA(PKC激動劑)孵育30min后，用抗GFP抗體

5、做活細胞表面染色，結果發(fā)現4.1±1.5％轉染細胞(表達有綠色熒光蛋白)表面染色陽性，即GFP-NR2A獲得了細胞膜表面表達，而未經PMA處理的轉染細胞則無陽性染色，提示PKC的激活可以促進NR2A向細胞膜的運輸。我們進一步通過轉染C末端部分缺失的NR2A，證明了NR2A亞單位的C末端1149D-1464V區(qū)域可能介導了這一作用。然而，表面表達有NR2A的HEK293細胞采用全細胞膜片鉗法并未能記錄到谷氨酸誘發(fā)的電流，也尚不能確認表面表

6、達的NR2A亞單位是單體形式還是同聚體。 本研究的第三部分，我們研究了PSD95對NR2A膜轉運的影響。結果發(fā)現當GFP-PSD95與NR2A共表達于HEK293細胞時，部分轉染細胞(13.2±3.1％)的胞漿中具有一些GFP-PSD95和NR2A高密度且共定位的區(qū)域，這些區(qū)域同時也能被高爾基體特異性染料(GolgiTracker)和早期內體抗體EEA1所標記，提示可能是相應的亞細胞器。而且，經1mMPMA孵育后含有這種GFP-