NMDA受體及其亞單位在大鼠NSCs增殖、分化以及腦缺血中作用的研究.pdf

1、第一部分：NMDA對大鼠海馬神經(jīng)干細胞增殖和分化的影響 目的:觀測體外培養(yǎng)胎鼠海馬神經(jīng)干細胞NMDA受體亞單位的表達情況，并探討NMDA對神經(jīng)干細胞增殖以及分化為神經(jīng)細胞的作用。 方法: 1、從孕18～19d大鼠海馬分離神經(jīng)干細胞(NSCs)，無血清培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)、單細胞克隆，誘導分化后行Nestin、β-ⅢTubulin和GFAP免疫細胞化學反應鑒定細胞性質(zhì)和類型。 2、取原代、1代、2代培養(yǎng)處于指數(shù)生

2、長期的NsCs進行①NR1、NR2A、NR2B免疫熒光細胞染色；②Western Blot檢測NR1、NR2A、NR2B蛋白質(zhì)的表達；⑨RT-PCR測NR1、NR2A、NR2BmRNA的表達。 3、將傳代培養(yǎng)1次NSCs與不同濃度NMDA共同培養(yǎng)3d、7d、12d，MTT法測細胞增殖情況。 4、將傳代培養(yǎng)1次NSCs與不同濃度NMDA共同培養(yǎng)3d，用含10％FBS的DMEM/F12誘導貼壁分化，分別于7d、12d行β-Ⅲ

3、Tubulin免疫細胞化學染色。光鏡下用網(wǎng)格目鏡尺計數(shù)細胞數(shù)量，以計算神經(jīng)元的分化比例。 結果: 1、從胎鼠海馬分離培養(yǎng)的細胞具有自我更新能力和多分化潛能。表達神經(jīng)上皮干細胞蛋白(Nestin)，分化后呈β-ⅢTubulin、GFAP免疫反應陽性。 2、1代、2代NSCs NMDA受體亞單位NR1、NR2A、NR2B均呈免疫熒光反應陽性。Western blot結果顯示，在115KD、177KD和178KD處出現(xiàn)

4、陽性條帶?；叶燃敖y(tǒng)計學分析，顯示三種亞單位的光密度值在原代、1代和2代均無明顯差異。原代、1代和2代細胞，RT-PCR反應產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳在402bp、280bp和220bp處出現(xiàn)強熒光條帶。 3、MTT結果顯示，NMDA作用3d、7d和12d時，100μM NMDA組與正常組OD值相比明顯增加(P<0.05)，其它各組與正常組OD值相比差異無統(tǒng)計學意義，各實驗組OD值相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 4、誘導分

5、化7d，12d時，正常組陽性細胞率分別為47.6％，41.5％。在兩個時間點各組神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元的比例與相應正常組比較差異無統(tǒng)計學意義，且各組間比較差異也無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 結論: 1、從胎鼠海馬分離培養(yǎng)的細胞具備神經(jīng)干細胞的基本屬性，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的干細胞。 2、早期培養(yǎng)的海馬NSCs中NR1、NR2A、NR2B蛋白質(zhì)和mRNA穩(wěn)定表達。 3、NMDA濃度為100gM持續(xù)作用時，對胎鼠

6、海馬NSCs增殖有促進作用。 4、一定條件下，NMDA在濃度為100μM及其以下時，不影響神經(jīng)干細胞的分化趨勢。 第二部分：NMDA受體亞單位2B在海馬缺血再灌注損傷中的作用 目的:探討NMDA受體亞單位2B選擇性拮抗劑Ro25-6981對成年大鼠短暫性前腦缺血再灌注海馬CA1區(qū)損傷神經(jīng)元保護作用和神經(jīng)發(fā)生的影響。 方法:健康成年雄性SD大鼠(250±25 g)隨機分為正常組、假手術組(又分藥物組、生理鹽

7、水對照組)和缺血再灌注組(又分藥物組、生理鹽水對照組)。采用四動脈阻斷(4AO)大鼠前腦缺血15 min再灌注模型。假手術組和手術組大鼠均于術前30 min腹腔注射不同劑量Ro25-6981(0.3mg/kg、0.6 mg/kg、1.2 mg/kg)、生理鹽水(NS)。采用焦油紫、TUNEL染色以及免疫組織化學技術顯示再灌注第1d、3d、7d天各組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞的構筑及病理改變、細胞凋亡以及BrdU陽性細胞。計數(shù)各組大鼠海馬C

8、A1區(qū)TUNEL、BrdU陽性細胞。 結果: 1、焦油紫結果顯示正常大鼠海馬錐體細胞境界清楚，排列整齊，胞漿被染成淡紫色，胞核不著色，核仁著色。假手術組細胞形態(tài)未見明顯改變。短暫性前腦缺血后1d，海馬CA1區(qū)也未見細胞數(shù)量和形態(tài)的明顯改變。缺血后3d，CA1區(qū)出現(xiàn)壞死細胞，特征為體積明顯縮小，細胞間隙擴大，細胞固縮呈深紫色。缺血后7d，CA1區(qū)壞死細胞體積進一步縮小，呈“米粒”狀散在分布在正常細胞之間。 2、短暫

9、性前腦缺血再灌后1d，海馬CA1區(qū)錐體細胞層出現(xiàn)TUNEL，陽性細胞，為11.33±1.17個/mm<'2>，再灌后3d時陽性細胞增多，達到43.33±1.47個/mm<'2>，再灌后7d時有所減少。再灌后3d，手術組中注射0.6 mg/kg Ro25-6981組的凋亡細胞數(shù)與相應對照組凋亡數(shù)相比明顯減少(P<0.01)。 3、BrdU陽性細胞胞核為圓形，核染為棕黃色。缺血刺激海馬CA1區(qū)細胞增殖，1d開始，3d增殖達高峰，Br