干貝素對(duì)戊四氮致癇大鼠海馬CA1區(qū)NR2A受體表達(dá)的影響.pdf

1、癲癇是一種危及人類健康的常見疾病。癲癇發(fā)作是大腦神經(jīng)元突發(fā)性異常放電,導(dǎo)致的一種短暫的大腦功能障礙(Chang& Lowenstein,2003)。癲癇的特點(diǎn)是短暫性、反復(fù)性和相對(duì)刻板性。目前我國(guó)約有800萬(wàn)左右癲癇患者,且每年有40萬(wàn)新發(fā)病人。癲癇發(fā)作不僅使患者痛苦,降低其生活質(zhì)量,對(duì)其家人的生活也造成很大影響。
　　 目前對(duì)于癲癇發(fā)病的機(jī)制尚無(wú)明確的定論,研究證明,NMDA受體的過度激活在癲癇病的產(chǎn)生過程中起重要的作用,癲癇

2、發(fā)作時(shí),神經(jīng)元興奮性增強(qiáng)引起興奮性谷氨酸遞質(zhì)釋放增加,細(xì)胞外谷氨酸濃度增高。大量的谷氨酸過度激活神經(jīng)元膜上的NMDA受體,引起Ca2+內(nèi)流,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號(hào)過度激活和神經(jīng)元興奮性異常增高,最終結(jié)果是神經(jīng)元死亡和大腦神經(jīng)元環(huán)路異常激活所致的癲癇的產(chǎn)生。
　　 干貝素又稱琥珀酸鈉(sodium succinate,SS),是廣泛存在于海洋生物中的有機(jī)鹽。琥珀酸是中藥琥珀的主要活性成分,具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗驚厥等多種藥理效果。琥珀酸是三羧

3、酸循環(huán)的中間代謝物,其化學(xué)結(jié)構(gòu)與?；撬?、興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸和抑制性氨基酸神經(jīng)遞γ-GABA相似,提示琥珀酸可能是一種腦內(nèi)天然抗癲癇的內(nèi)源性神經(jīng)調(diào)質(zhì)(modulator),加之琥珀酸具有毒性小、來(lái)源廣、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn),所以需要我們進(jìn)一步研究探討并最終將其臨床推廣。目前已有報(bào)道稱干貝素可降低腦內(nèi)谷氨酸水平,但其抑制作用是否與NR2A受體有直接關(guān)系并無(wú)報(bào)導(dǎo),我們將在本實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)。
　　 目的:我們利用戊四氮(Pentylene

4、tetrazol,PTZ)制造癲癇大鼠模型,以不同劑量的干貝素及NMDAR2A受體選擇性抑制劑NVP-AAM077進(jìn)行干預(yù),檢測(cè)海馬CA1區(qū)NR2A受體的表達(dá)情況,進(jìn)一步探討干貝素發(fā)揮中樞抑制作用是否是直接通過影響NR2A而形成的。
　　 方法:
　　 1分組
　　 采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)。將70只成年雄性Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)抽取8只作為正常組(normal),其余62只用戊四氮制造癲癇模型,篩選造模合

5、格大鼠40只進(jìn)行隨機(jī)分組:戊四氮致癇組(PTZ)和致癇后干貝素每次0.8g/kg干預(yù)組(PTZ+SS1+NS,MT1)、致癇后干貝素1.2g/kg干預(yù)組(PTZ+SS2+NS,MT2)、致癇后干貝素0.8g/kg、NVP-AAM077干預(yù)組(PTZ+SS1+NVP,MT3)、致癇后干貝素1.2g/kg、NVP-AAM077干預(yù)組(PTZ+SS2+MVP,MT4)。
　　 2造模
　　 正常組腹腔注射生理鹽水,其余各組致癇

6、大鼠按45mg/kg腹腔注射PTZ(1％濃度)溶液,每次注射間隔24小時(shí),連續(xù)3天,直到大鼠完全點(diǎn)燃(出現(xiàn)RacineⅣ-Ⅴ級(jí))。
　　 3給藥
　　 MT3及MT4組側(cè)腦室注射NVP-AAM0775μl,而MT1組、MT2組、PTZ組及正常組側(cè)腦室注射生理鹽水5μl。各側(cè)腦室給藥組給藥速度均為1μl/分。
　　 各干貝素干預(yù)組于癲癇終止后30分鐘內(nèi)灌胃,MT1、MT3組給予干貝素0.8g/kg/d,連續(xù)3天;T

7、2、MT4組給予干貝素1.2g/kg/d,連續(xù)3天;PTZ組和正常組給予生理鹽水灌胃,連續(xù)3天。
　　 4腦電圖
　　 將大鼠麻醉后固定于固定架上,采用頭皮針狀電極單極導(dǎo)聯(lián)法,于大鼠左右顳處留置針灸針,待大鼠清醒后制作急性癲癇模型,觀察癇性放電的頻率及其振幅變化。
　　 5免疫組織化學(xué)染色
　　 麻醉狀態(tài)下經(jīng)左心室行主動(dòng)脈插管,4％多聚甲醛溶液進(jìn)行灌注,取腦固定,常規(guī)包埋,標(biāo)本冠狀位石蠟切片。經(jīng)過抗原修復(fù)

8、、山羊血清封閉后,加NR2A抗體,再經(jīng)二抗、三抗孵育,DAB顯色后置顯微鏡下觀察記錄。
　　 結(jié)果:
　　 1癲癇行為學(xué)
　　 腹腔注射PTZ后,造模大鼠均出現(xiàn)不同程度的癇性發(fā)作,造模成功。分別灌胃給予干貝素0.8g/kg.d、1.2g/kg.d次后,均可降低大鼠發(fā)作級(jí)別或延緩發(fā)作時(shí)間。
　　 2腦電圖學(xué)
　　 正常對(duì)照組大鼠腦電圖無(wú)異常,致癇大鼠腦電圖出現(xiàn)高幅多棘波。
　　 3 NR2A

9、選擇性抑制劑NVP-AAM077抗驚厥試驗(yàn)
　　 應(yīng)用NR2A選擇性抑制劑NVP-AAM077后,不影響癲癇大鼠腦電圖,也不影響大鼠達(dá)到各癲癇級(jí)別的時(shí)間。即本實(shí)驗(yàn)所用的NR2A選擇性抑制劑NVP-AAM077的計(jì)量沒有抗驚厥作用。
　　 4免疫組化法檢測(cè)海馬CA1區(qū)NMDANR2A光密度值結(jié)果
　　 戊四氮模型(PTZ)組與其它各組比較,NR2A密度最高都具有顯著性差異(P＜0.05)。干貝素干預(yù)組與干貝素、NV

10、P-AAM077干預(yù)組之間NR2A密度強(qiáng)弱有顯著性差異(P＜0.05),光鏡下觀察,免疫組織化學(xué)染色后,空白對(duì)照組NR2A陽(yáng)性細(xì)胞在大腦皮質(zhì)各層內(nèi)彌散分布。戊四氮模型(PTZ)組與其它各組相比,大腦皮層及海馬NR2A免疫反應(yīng)染色明顯加深。
　　 結(jié)論:
　　 1干貝素能降低戊四氮致癇大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元NR2A的表達(dá)。
　　 2干貝素可降低PTZ致癇大鼠的發(fā)作級(jí)別或延緩發(fā)作時(shí)間,其可能的作用機(jī)制是經(jīng)NR2A途徑發(fā)揮中