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文檔簡介
1、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin,mTOR)能夠調(diào)節(jié)細胞的生長。mTOR能夠組成兩種功能復(fù)合物:mTORC1和mTORC2,其中mTORC1能夠通過其上游多種“感受器”感受細胞內(nèi)外的一系列信號變化,包括能量狀態(tài)、生長因子和激素、營養(yǎng)因子等,來調(diào)節(jié)細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成和降解,從而調(diào)控細胞生長。營養(yǎng)因子中,氨基酸既是蛋白質(zhì)合成的必需底物,也是mTORC1活性調(diào)節(jié)的必要的信號分子。在氨基酸中,亮氨
2、酸、谷氨酰胺、精氨酸被認為能有效調(diào)節(jié)mTORC1活性。且氨基酸轉(zhuǎn)運感受體參與氨基酸依賴性的mTOR活性調(diào)節(jié)過程。
近幾年研究發(fā)現(xiàn)一種G蛋白偶聯(lián)受體T1R1/T1R3(Taste Receptor Type1subtype1/3,T1R1/T1R3)能夠作為廣譜性的氨基酸感受體感應(yīng)胞外氨基酸,通過促進胞內(nèi)Ca2+增加激活ERK1/2來參與調(diào)控mTOR。然而目前研究主要針對胞外總的氨基酸,究竟哪些氨基酸參與該過程并不清楚,因此T1
3、R1/T1R3介導(dǎo)調(diào)控mTOR信號是否具有氨基酸特異性及其調(diào)控機制有待進一步闡明。
本課題研究內(nèi)容由兩部分組成,本實驗以C2C12小鼠成肌細胞作為研究對象,第一部分在確定T1R1/T1R3對mTOR信號具有調(diào)控作用的基礎(chǔ)上,篩選由T1R1/T1R3介導(dǎo)的調(diào)控mTOR信號的胞外氨基酸。第二部分進一步探索T1R1/T1R3參與氨基酸依賴性的mTOR活性調(diào)節(jié)的機制及其特異性。
第一部分主要結(jié)果如下:
1、Q-PC
4、R方法測定2%馬血清誘導(dǎo)的C2C12細胞分化0、2、4、8天,T1R1/T1R3的表達情況。研究發(fā)現(xiàn)T1R1/T1R3在小鼠C2C12成肌細胞誘導(dǎo)分化過程中有表達。
2、C2C12成肌細胞中T1R1/T1R3能介導(dǎo)氨基酸調(diào)控mTOR信號。在有氨基酸存在的情況下,利用信號通路抑制劑及激動劑處理細胞,Western blot方法測定p-S6K1、p-mTOR磷酸化水平的變化,鑒定T1R1/T1R3對蛋白質(zhì)合成的作用,并篩選出最佳抑
5、制劑濃度。研究發(fā)現(xiàn)Ca2+螯合劑BAPTA-AM及ERK1/2活性抑制劑U0126都能極顯著抑制氨基酸誘導(dǎo)的mTORC1的激活(P<0.01),且具有濃度依賴性效應(yīng)。T1R1對氨基酸的特異性增強劑IMP預(yù)處理細胞則能顯著增加氨基酸誘導(dǎo)的mTORC1的激活(P<0.05)。并且BAPTA-AM濃度為10μmol/L,U0126濃度為15μmol/L,即能達到極顯著抑制效果。說明C2C12成肌細胞內(nèi)T1R1/T1R3也能介導(dǎo)氨基酸通過促進胞
6、內(nèi)Ca2+升高及激活ERK1/2來參與調(diào)控mTOR信號。
3、蛋氨酸參與T1R1/T1R3介導(dǎo)調(diào)控蛋白質(zhì)合成。不同氨基酸處理細胞后,Western blot方法測定p-S6K1、p-mTOR磷酸化水平的變化、SUnSET非放射性方法檢測蛋白質(zhì)合成速率、Q-PCR檢測蛋白質(zhì)降解標志基因,篩選出參與T1R1/T1R3介導(dǎo)的調(diào)控mTOR信號的胞外氨基酸。研究發(fā)現(xiàn)七種能引起胞內(nèi)Ca2+增加的氨基酸(50mmol/L)中只有蛋氨酸能極顯
7、著激活mTORC1(P<0.01),蛋氨酸能極顯著促進蛋白質(zhì)合成速率,該過程依賴于mTOR,并且能極顯著抑制蛋白質(zhì)降解途徑關(guān)鍵基因Atrogin-1、MuRF-1的mRNA表達水平(P<0.01)。說明參與T1R1/T1R3介導(dǎo)的調(diào)控mTOR信號的胞外氨基酸主要為蛋氨酸,表明蛋氨酸可能成為研究氨基酸受體T1R1/T1R3介導(dǎo)調(diào)控mTOR信號的主要氨基酸。
第二部分主要結(jié)果如下:
1、蛋氨酸能被T1R1/T1R3介導(dǎo)通
8、過促進胞內(nèi)Ca2+增加激活ERK1/2,從而調(diào)控mTOR活性。在有蛋氨酸誘導(dǎo)的情況下,利用信號通路抑制劑及激動劑處理,F(xiàn)luo-8檢測胞內(nèi)Ca2+變化,Western blot方法測定p-S6K1、p-mTOR磷酸化水平的變化、SUnSET非放射性方法檢測蛋白質(zhì)合成速率,驗證C2C12成肌細胞中蛋氨酸調(diào)控mTOR信號的分子機制。研究發(fā)現(xiàn)Met能促進胞內(nèi)Ca2+增加,Ca2+螯合劑BAPTA-AM、PLC特異性抑制劑U73122、ERK1
9、/2活性抑制劑U0126都能極顯著抑制蛋氨酸誘導(dǎo)的mTORC1的激活(P<0.01),T1R1/T1R3對氨基酸的特異性增強劑IMP則能顯著增加蛋氨酸誘導(dǎo)的mTORC1的激活(P<0.05)。說明蛋氨酸能激活mTORC1,且蛋氨酸調(diào)控mTOR依賴于T1R1/T1R3-PLC-Ca2+-ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
2、ERK1/2在T1R1/T1R3介導(dǎo)氨基酸調(diào)控mTOR中具有一定作用。Western blot檢測通路關(guān)鍵蛋白p
10、-ERK1/2的水平,驗證ERK1/2活性對蛋氨酸調(diào)控mTOR的重要性。研究發(fā)現(xiàn)BAPTA-AM處理能極顯著增加蛋氨酸引起的p-ERK1/2水平(P<0.01),且具有濃度依賴性效應(yīng),與p-S6K1變化水平相反。IMP處理則能抑制蛋氨酸引起的p-ERK1/2水平,U0126處理抑制ERK1/2活性則能抑制蛋氨酸引起的p-ERK1/2水平。
3、T1R1/T1R3介導(dǎo)氨基酸調(diào)控mTOR信號具有氨基酸特異性。利用不同類型氨基酸處理
11、細胞,Western blot檢測通路關(guān)鍵蛋白水平的變化,探索T1R1/T1R3介導(dǎo)氨基酸激活mTORC1的氨基酸特異性。研究發(fā)現(xiàn)蛋氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸及丙氨酸五種氨基酸處理細胞,隨著氨基酸濃度增加,蛋氨酸及亮氨酸能誘導(dǎo)通路關(guān)鍵蛋白的水平逐漸增加,而谷氨酰胺、甘氨酸及丙氨酸誘導(dǎo)則無顯著變化。亮氨酸激活mTORC1也依賴于胞內(nèi)Ca2+及ERK1/2。證實T1R1/T1R3調(diào)控mTOR信號的主要是蛋氨酸,其他氨基酸效果不顯著。
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