油菜(Brassica napus)種子萌發(fā)響應(yīng)NaCl脅迫的生理學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、種子是植物繁殖的基礎(chǔ)，其萌發(fā)過(guò)程是植物生活史中最重要的階段之一，且該階段對(duì)鹽脅迫極為敏感。鹽脅迫是嚴(yán)重影響植物生長(zhǎng)，限制產(chǎn)量和區(qū)域分布的重要因素之一。鹽脅迫首先通過(guò)阻礙水分的吸收影響種子的萌發(fā)。其次，鹽進(jìn)入種子會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞水平的損傷，從而進(jìn)一步抑制種子的萌發(fā)。在細(xì)胞水平上，離子進(jìn)入細(xì)胞后會(huì)打破離子穩(wěn)態(tài)以及產(chǎn)生活性氧自由基?；钚匝踝杂苫T發(fā)的氧化脅迫能夠造成生物大分子結(jié)構(gòu)的損傷，從而對(duì)細(xì)胞的代謝造成有害的影響。
　　油菜種子是植物油的

2、重要來(lái)源。本文以油菜種子為研究材料探索種子萌發(fā)過(guò)程中的耐鹽生理機(jī)制。分析了不同濃度NaCl脅迫（0、50、100和200mM）以及與相應(yīng)鹽脅迫等滲的甘露醇脅迫（0、100、200和400mM）下種子萌發(fā)率和根芽生長(zhǎng)等的變化;檢測(cè)了成熟種子及不同濃度NaCl脅迫和與鹽脅迫等滲的甘露醇脅迫下萌發(fā)種子中含水量、膜透性、滲透保護(hù)物質(zhì)、活性氧自由基、抗氧化酶和抗氧化劑等指標(biāo);比較了成熟種子和NaCl脅迫下萌發(fā)種子中Na+、K+和Ca2+的含量。同

3、時(shí)，我們利用高通量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定到種子萌發(fā)前后54種差異表達(dá)蛋白質(zhì)，以及鹽脅迫下萌發(fā)種子中46種差異表達(dá)蛋白質(zhì)。
　　生理學(xué)研究結(jié)果表明，在種子萌發(fā)過(guò)程中，可溶性糖含量下降、脯氨酸和甜菜堿含量上升，100 mMNaCl條件下，可溶性糖含量、脯氨酸和甜菜堿含量均上升，但在200mM NaCl條件下，脯氨酸和甜菜堿含量上升。200 mM NaCl條件下，油菜萌發(fā)種子中Na+含量顯著增加，K+和Ca2+含量顯著下降。種子萌發(fā)過(guò)程中，

4、丙二醛含量增加，但鹽脅迫下萌發(fā)種子中的丙二醛含量和相對(duì)電導(dǎo)率均增加。種子萌發(fā)過(guò)程中及鹽脅迫下萌發(fā)種子中活性氧自由基含量升高。種子萌發(fā)過(guò)程中及100mMNaCl條件下，超氧化物歧化酶途徑、過(guò)氧化氫酶途徑、抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶途徑及過(guò)氧化物酶途徑相關(guān)酶的活性升高，且抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)底物含量也升高。200mMNaCl條件下，多數(shù)抗氧化酶活性與對(duì)照相比無(wú)差異或降低，且該條件下所有抗氧化酶活性均比400mM甘露醇處理下

5、低。
　　同時(shí)，我們利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)獲得了成熟種子和萌發(fā)種子應(yīng)答0、100和200 mMNaCl脅迫的蛋白質(zhì)表達(dá)譜。在成熟種子與萌發(fā)種子的雙向電泳凝膠圖中，獲得了69個(gè)可重復(fù)的差異蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。經(jīng)質(zhì)譜鑒定分析，獲得了59個(gè)鑒定結(jié)果，其中54個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)被鑒定為單一蛋白質(zhì)，5個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)含有1種以上蛋白質(zhì)。在萌發(fā)種子應(yīng)答NaCl脅迫的雙向電泳凝膠圖中，獲得了53個(gè)可重復(fù)的差異蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。經(jīng)質(zhì)譜鑒定分析，獲得了50個(gè)鑒定結(jié)果，其中46

6、個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)被鑒定為單一蛋白質(zhì)，4個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)含有1種以上蛋白質(zhì)。在種子萌發(fā)過(guò)程中，醛糖還原酶表達(dá)豐度增加，晚期胚胎豐富(LEA)蛋白表達(dá)豐度下降。在100mM NaCl條件下，LEA蛋白表達(dá)豐度下降。但在200mM NaCl條件下，該蛋白表達(dá)豐度與對(duì)照無(wú)明顯差異。超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化還原蛋白(Prx)和(DHAR)的表達(dá)豐度在種子萌發(fā)過(guò)程中增加，且SOD和乙二醛酶(GLO)的表達(dá)豐度在200mMNaCl條件下增加。種子萌發(fā)

7、過(guò)程中，RNA加工及蛋白質(zhì)命運(yùn)相關(guān)蛋白的表達(dá)豐度增加。而在200mM NaCl條件下，熱休克蛋白(HSP)70、含ACD結(jié)構(gòu)域蛋白、20S蛋白酶體β亞單位表達(dá)豐度降低，但熱休克同源蛋白(HSC)70.1、HSP101、線粒體加工肽酶(MPP)、HSC70-2、HSP60和HSP90表達(dá)豐度增加。此外，糖酵解相關(guān)酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和磷酸甘油酸激酶(PGK)以及三羧酸循環(huán)相關(guān)酶蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)、異檸檬酸脫氫酶(ID

8、H)和烏頭酸酶的表達(dá)豐度在種子萌發(fā)過(guò)程中增加。且在鹽脅迫下，GAPDH和烏頭酸酶的表達(dá)豐度也增加。在種子萌發(fā)過(guò)程中，甲硫氨酸合酶(MES)、腺苷甲硫氨酸合酶(SAMS)和腺苷高半胱氨酸合酶(AdoHcyase)的表達(dá)豐度增加，但鹽脅迫下，這三種酶的表達(dá)豐度表現(xiàn)出多種變化。
　　綜合生理學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果我們得出如下結(jié)論:(1)鹽脅迫下，萌發(fā)種子通過(guò)合成可溶性糖、脯氨酸和甜菜堿維持細(xì)胞滲透平衡。在200mM NaCl條件下，油菜萌發(fā)

9、種子中的離子穩(wěn)態(tài)被打破、毒性顯著增強(qiáng)。100mM NaCl處理下，油菜萌發(fā)種子中LEA蛋白降解無(wú)影響、有利于種子萌發(fā)。而200mM NaCl處理下，LEA蛋白降解可能受到抑制。(2)油菜萌發(fā)種子及100mM NaCl處理下的萌發(fā)種子通過(guò)SOD途徑、CAT途徑、AsA-GSH循環(huán)、GPX途徑及POD途徑清除ROS。SOD、Prx和DHAR的表達(dá)豐度增加表明它們清除ROS方面也具有重要作用。但200mM NaCl脅迫條件下主要通過(guò)GST途徑

10、和POD途徑清除。GLO和SOD表達(dá)豐度增加有助于清除有害物質(zhì)。(3)油菜萌發(fā)種子中RNA代謝和蛋白質(zhì)命運(yùn)相關(guān)過(guò)程均非?；钴S。鹽脅迫條件下，油菜萌發(fā)種子胞質(zhì)蛋白質(zhì)合成代謝和線粒體蛋白質(zhì)合成代謝都參與應(yīng)對(duì)鹽脅迫。(4)油菜種子萌發(fā)過(guò)程中，可溶性糖被迅速動(dòng)員，并通過(guò)糖酵解和TCA循環(huán)途徑提供能量。鹽脅迫條件下，油菜萌發(fā)種子中糖酵解途徑中甘油醛-3-磷酸脫氫酶和TCA循環(huán)中烏頭酸酶表達(dá)豐度增強(qiáng)，可能為應(yīng)對(duì)鹽脅迫提供能量。(5)油菜種子萌發(fā)過(guò)程