記憶缺失性貝毒免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條的研制.pdf

1、記憶缺失性貝毒（ASP）是有毒赤潮硅藻分泌產(chǎn)生的毒素，其主要活性成分軟骨藻酸（domic acid, DA）是一種氨基酸類毒素。海洋貝類通過食物鏈的傳遞作用可在體內(nèi)累積DA，人及海洋哺乳動(dòng)物中毒之后，會(huì)干擾中樞神經(jīng)系統(tǒng)，發(fā)生暫時(shí)性失去記憶甚至死亡。
　　膠體金免疫層析技術(shù)（colloidal gold immunochromatographic assay, GICA）是以條狀纖維層析材料為固相載體，通過毛細(xì)管作用原理，以膠體金為

2、示蹤物來顯示結(jié)果的一種新型檢測(cè)方法。該方法具有操作簡(jiǎn)單、快速、分析結(jié)果易于判斷，無需任何儀器、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，適用于現(xiàn)場(chǎng)批量檢測(cè)。近年來，膠體金免疫層析技術(shù)己成為當(dāng)今發(fā)展最快速的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)之一，在毒素檢測(cè)等領(lǐng)域得到了廣泛的發(fā)展。
　　本研究采用單克隆抗體技術(shù)和膠體金免疫層析技術(shù)，制備快速檢測(cè)軟骨藻酸的膠體金免疫層析試紙條。取得了如下研究成果：
　　1.軟骨藻酸免疫抗原和包被抗原的制備
　　采用活潑酯法，將軟骨藻酸與

3、載體蛋白鉬孔血藍(lán)蛋白（KLH）、牛血清白蛋白（BSA）進(jìn)行偶聯(lián)，制備了相應(yīng)的免疫抗原DA-KLH和包被抗原DA-BSA，紫外掃描定性鑒定偶聯(lián)成功，偶聯(lián)比分別為1:25和1:16。2.軟骨藻酸單克隆抗體的制備
　　免疫抗原DA-KLH免疫BALB/c小鼠，利用雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)成功制備2株能穩(wěn)定分泌抗軟骨藻酸單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，抗體亞類分別為IgG1和IgG2a，通過體內(nèi)誘生腹水法獲得純化后效價(jià)為1：64000的抗軟骨藻酸單克

4、隆抗體。
　　3.膠體金及軟骨藻酸金標(biāo)抗體的制備
　　采用檸檬酸三鈉還原氯金酸法，成功確立了20nm膠體金的制備條件，并利用制備好的膠體金，對(duì)前述制備的抗軟骨藻酸單克隆抗體進(jìn)行了膠體金標(biāo)記條件的摸索，成功確立了單克隆抗體的膠體金標(biāo)記條件：最適pH是9.0，最適標(biāo)記穩(wěn)定量是9.72μg/mL膠體金，并制備金標(biāo)抗體。4.軟骨藻酸膠體金免疫層析試紙條的制備
　　對(duì)軟骨藻酸膠體金免疫層析試紙條的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化，并確立了最佳條

5、件。最終選擇SB06玻璃纖維素膜涂布4×稀釋度的金標(biāo)抗體構(gòu)成膠體金結(jié)合墊；選擇Millipore180 NC膜作為層析膜，羊抗鼠IgG（1mg/mL）和1μL包被抗原DA-BSA（0.867 mg/mL）噴涂在NC膜上，分別作為質(zhì)控線和檢測(cè)線；選用SB08玻璃纖維素膜作為樣品墊；SX18吸水紙作為吸收墊；將膠體金結(jié)合墊、NC膜、樣品墊和吸收墊組裝成軟骨藻酸膠體金免疫層析試紙條
　　5.軟骨藻酸膠體金免疫層析試紙條的應(yīng)用