Rho-GTPase調(diào)節(jié)人黑素細(xì)胞和B16黑素瘤細(xì)胞樹突生成和黑素轉(zhuǎn)運(yùn)的作用研究.pdf

1、第一部分:人純化ET-1通過調(diào)節(jié)RhoA和Rac1活性對(duì)人黑素細(xì)胞樹突生成的影響
　　目的:探討311nmUVB對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞分泌內(nèi)皮素(ET)-1的影響及人純化ET-1通過調(diào)節(jié)RhoA和Rac1活性對(duì)人黑素細(xì)胞樹突生成的作用。
　　方法:采用二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法檢測(cè)311nmUVB對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞存活率的影響。應(yīng)用ELISA法檢測(cè)311nmUVB照射人角質(zhì)形成細(xì)胞后收集的培養(yǎng)上清液中白細(xì)胞介素(IL)-1a、ET

2、-1和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的濃度。采用相差顯微鏡觀察人純化ET-1對(duì)人黑素細(xì)胞樹突生成的影響。應(yīng)用pulldown方法檢測(cè)人純化ET-1對(duì)人黑素細(xì)胞GTP-RhoA和GTP-Rac1蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:在25和50mJ/cm2劑量下,311nmUVB照射后24h對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞的存活率分別為102.55±1.82％和100.57±1.61%,與對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;在100和200mJ/cm2時(shí),存活率分別

3、下降至91.38±2.41%和80.56±3.31%,與對(duì)照組比較明顯下降,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在25和50mJ/cm2劑量時(shí),人角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL—1a和ET-1的濃度與對(duì)照組比較明顯升高(P<0.05),其中ET-1在25mJ/cm2時(shí)達(dá)到38.85±1.52pg/mL。未經(jīng)ET-1處理的人黑素細(xì)胞樹突多為雙極或三極,而經(jīng)ET-1處理的細(xì)胞胞體增大,樹突明顯增多,多于3個(gè)樹突(不包括3個(gè))以上的細(xì)胞(63.67±

4、5.51%)較未處理細(xì)胞(28.67±3.06%)明顯增多(P<0.01)。Pulldown實(shí)驗(yàn)顯示人黑素細(xì)胞GTP-Rac1的表達(dá)在ET-1處理后逐漸升高,10min時(shí)達(dá)到處理前的4倍,隨后逐漸下調(diào),但處理60min時(shí)仍高于處理前水平;而GTP-RhoA表達(dá)開始就明顯下降,10min時(shí)降到處理前的1/3,之后有所回升,在處理60min時(shí)幾乎達(dá)到處理前水平。
　　結(jié)論:311nmUVB具有促進(jìn)人角質(zhì)形成細(xì)胞分泌ET-1及ET-1可

5、通過活化Rac1和抑制RhoA雙重途徑促進(jìn)人黑素細(xì)胞樹突生成的作用。第二部分:311nmUVB通過活化Rac1對(duì)B16黑素瘤細(xì)胞F-actin和樹突生成的影響
　　目的:探討311nmUVB通過活化Rac1對(duì)B16黑素瘤細(xì)胞F-actin和樹突生成的影響。
　　方法:采用MTT法檢測(cè)311nmUVB對(duì)B16黑素瘤細(xì)胞存活率的影響。應(yīng)用相差顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡分別觀察311nmUVB對(duì)B16黑素瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化和細(xì)胞骨架

6、蛋白F-actin的影響。應(yīng)用pulldown方法檢測(cè)311nmUVB照射前及照射后15min、30min、60min和120minB16黑素瘤細(xì)胞GTP-RhoA和GTP-Rac1蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:在25、50和100mJ/cm2劑量下,311nmUVB照射后24h對(duì)B16黑素瘤細(xì)胞的存活率與對(duì)照組比較無明顯差異(P>0.05);在200和300mJ/cm2時(shí),B16黑素瘤細(xì)胞的存活率明顯下降,存活率分別為87.75±

7、2.66%和79.40±2.31%(P<0.01)。311nmUVB100mJ/cm2照射24h后,B16黑素瘤細(xì)胞呈胞體增大近似球狀,樹突明顯增多似樹枝,與未照光細(xì)胞比較明顯增多((P<0.01),而未照光細(xì)胞樹突僅表現(xiàn)為雙極或三極。激光共聚焦顯微鏡顯示,B16黑素瘤細(xì)胞在饑餓24h而未經(jīng)311nmUVB照射時(shí),細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白張力纖維紋理清晰,而經(jīng)311nmUVB100mJ/cm2照射30min和60min后細(xì)胞骨架蛋白張力纖維解聚,

8、紋理欠清晰,并逐漸加重,在照射6h時(shí)張力纖維紋理模糊,呈團(tuán)塊狀。Pulldown實(shí)驗(yàn)顯示,與照射前比較311nmUVB100mJ/cm2照射后15min和30minB16黑素瘤細(xì)胞GTP-Rac1蛋白的表達(dá)逐漸升高,尤其在30min時(shí)表達(dá)是照射前的2倍之多,隨后略有下降,但在照射后60min和120min表達(dá)仍高于對(duì)照組;而GTP-RhoA蛋白在照射后略有下降,而后逐漸升高,在120min時(shí)升高到照射前的1.6倍。
　　結(jié)論:31

9、1nmUVB可通過活化Rac1誘導(dǎo)B16鼠黑素瘤細(xì)胞內(nèi)張力纖維F-actin的解聚,進(jìn)而促進(jìn)B16黑素瘤細(xì)胞胞體增大和樹突增多等形態(tài)學(xué)的改變。
　　第三部分:熊果苷和淫羊藿苷對(duì)人黑素細(xì)胞樹突生成及共培養(yǎng)中黑素小體轉(zhuǎn)運(yùn)的影響
　　目的:探討熊果苷和淫羊藿苷對(duì)人黑素細(xì)胞樹突生成及細(xì)胞共培養(yǎng)中黑素小體轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。
　　方法:MTT法檢測(cè)熊果苷和淫羊藿苷對(duì)人黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞存活率的影響。相差顯微鏡觀察熊果苷和淫

10、羊藿苷對(duì)人黑素細(xì)胞樹突生成的影響。pulldown方法檢測(cè)熊果苷對(duì)人黑素細(xì)胞GTP-RhoA和GTP-Rac1蛋白的表達(dá)情況。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)熊果苷和淫羊藿苷對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞中黑素小體轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。
　　結(jié)果:熊果苷在藥物濃度320-640mmol/L之間時(shí)抑制細(xì)胞增殖作用明顯(P<0.05),在40-160mmol/L時(shí),抑制作用不明顯;淫羊藿苷具有促細(xì)胞生長(zhǎng)的作用,但當(dāng)藥物濃度在120-240mmol/L之間時(shí),促增殖作用下降。經(jīng)

11、熊果苷(160mmol/L)處理后,黑素細(xì)胞樹突退縮,樹突平均長(zhǎng)度為110.67±7.37μm,與對(duì)照組(267±10.15μm)比較有顯著性差異(P<0.01);而經(jīng)淫羊藿苷處理后,黑素細(xì)胞樹突長(zhǎng)度雖略增加(285±10.54μm),但與對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。熊果苷(160mmol/L)處理15min后黑素細(xì)胞GTP-RhoA蛋白表達(dá)增多,30min時(shí)達(dá)到高峰,60min時(shí)表達(dá)出現(xiàn)下降,但在120min表達(dá)仍高于對(duì)照組;GTP-Ra