植物活性多糖對小鼠樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、自然界中植物種類多種多樣，具有免疫調(diào)節(jié)作用的藥用植物也是數(shù)量繁多，如果能將其中起主要作用的有效成分分離出來，研究其理化性質(zhì)及作用機理，對于植物功能性因子的研究及相應(yīng)功能食品的開發(fā)將具有非常重要的意義。 抗原提呈細(xì)胞( antigen-presenting cell，APCs)主要承擔(dān)對抗原物質(zhì)的攝取，加工，并將抗原肽呈遞給特異性T淋巴細(xì)胞，是啟動免疫應(yīng)答的關(guān)鍵因素。樹突狀細(xì)胞( dendritic cells，DCs)，是目前已

2、知功能最強的專職APCs，具有誘導(dǎo)初次免疫應(yīng)答的獨特功能，能有效刺激初始型T細(xì)胞(naive T cells)增殖，在機體細(xì)胞免疫和體液免疫調(diào)控中具有獨特的地位；巨噬細(xì)胞作為宿主天然免疫防御陣線的重要成員在先天性免疫防御和獲得性免疫應(yīng)答中同樣起著不可忽視的作用。 為探討中藥植物的免疫增強藥理機制，本研究初步建立了以小鼠骨髓來源DCs為靶細(xì)胞的植物化學(xué)物免疫活性篩選模型，在細(xì)胞水平初步探討了大粒車前子精制多糖(crude poly

3、saccharide from the seeds ofPlantago asiaticaL.，PL-PS)、大粒車前子多糖純品(polysaccharide from the seeds of Plantago asiatica L.，PLP)、毛蕊花苷( acteoside)、異毛蕊花苷(isoacteoside)、茶葉糖蛋白(tea glycoprotein，TGP)、青錢柳多糖(polysaccharides from Cycl

4、ocarya paliurus(Batal.) Iljinskaja，CPC)的免疫調(diào)節(jié)功能。在此基礎(chǔ)上，進一步研究了大粒車前子多糖PL-PS及PLP對小鼠骨髓來源DCs的分化、發(fā)育、成熟、遷移等方面的影響，并初步探討了PL-PS對同為APCs的巨噬細(xì)胞功能的影響，為車前子產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。現(xiàn)將本文主要研究結(jié)果歸納如下： 1.探討了PLP、CPC、PL-PS、TGP、毛蕊花苷和異毛蕊花苷對DCs前體細(xì)胞的細(xì)胞毒性。采用倒置顯

5、微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)；用MTT法檢測對細(xì)胞生長的增殖率；流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞的早期凋亡。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)各植物化學(xué)物處理后DCs前體細(xì)胞生長良好、細(xì)胞生存率高，對DCs前體細(xì)胞凋亡無明顯影響，青錢柳多糖、毛蕊花苷和異毛蕊花苷對小鼠DCs前體細(xì)胞具有顯著地促進增殖作用，提示青錢柳多糖、毛蕊花苷和異毛蕊花苷對小鼠DCs前體細(xì)胞的影響有可能通過直接誘導(dǎo)擴增及增強其細(xì)胞生物活性而發(fā)揮。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)本研究所采用的各植物化學(xué)物均無細(xì)胞毒性，可用于后續(xù)實驗，并為

6、臨床應(yīng)用及食用安全提供理論依據(jù)。 2.建立了DCs為靶細(xì)胞的植物化學(xué)物活性篩選模型。參照經(jīng)典文獻(xiàn)，結(jié)合國際上研究現(xiàn)狀，采用手法分離純化小鼠骨髓細(xì)胞，聯(lián)合rmGM-CSF和rmIL-4誘導(dǎo)分化培養(yǎng)5天后，用MACS免疫磁珠法對細(xì)胞進行進一步純化。通過采用各種形態(tài)學(xué)方法觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面分子表達(dá)對細(xì)胞進行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法可以獲得大量穩(wěn)定的高純度DCs，可用于后續(xù)植物化學(xué)物的免疫活性篩選。 3.應(yīng)用已建立

7、的以DCs為靶細(xì)胞的活性篩選模型，初步探討了PLP、CPC、PL-PS、TGP、毛蕊花苷和異毛蕊花苷的免疫調(diào)節(jié)活性。采用倒置顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)DCs經(jīng)PLP、CPC、PL-PS、TGP誘導(dǎo)后，細(xì)胞周圍突起增多，細(xì)胞體積增大，形態(tài)更加典型。經(jīng)毛蕊花苷和異毛蕊花苷刺激24 h后，與陰性對照組相比，細(xì)胞成團數(shù)量有所增加。MTT法檢測各植物化學(xué)物對DCs增殖的影響，發(fā)現(xiàn)大部分植物化學(xué)物在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)，對DCs的生長無顯著影響；毛蕊花苷和異毛蕊

8、花苷可促進DCs的增殖。流式細(xì)胞儀檢測各植物化學(xué)物對DCs表型和吞噬功能的影響，發(fā)現(xiàn)與目前公認(rèn)具有免疫促進功效并已應(yīng)用于腫瘤輔助治療的香菇多糖相似，PLP、PL-PS、毛蕊花苷和異毛蕊花苷在濃度為50μg/mL，TGP和CPC在濃度為100μg/mL時均可增強CD11c陽性細(xì)胞表達(dá)MHC II分子。并且發(fā)現(xiàn)經(jīng)各植物活性提取物誘導(dǎo)后DCs吞噬熒光標(biāo)記的葡聚糖的能力下降。研究結(jié)果初步發(fā)現(xiàn)PLP、CPC、PL-PS、TGP、毛蕊花苷和異毛蕊花

9、苷均具有促進DCs表型及功能成熟的作用，從而為后續(xù)進一步實驗提供理論依據(jù)。 4.探討了不同劑量大粒車前子多糖PL-PS及PLP對DCs表型及吞噬功能的影響。采用流式細(xì)胞分析技術(shù)分析不同劑量PL-PS和PLP對DCs表面MHCII、CD80、CD86及CD40表達(dá)水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PL-PS和PLP均可促進MHC II、CD80、CD86和CD40的表達(dá)，在10～200μg/mL濃度范圍內(nèi)，呈劑量依賴關(guān)系。且PL-PS、PLP同

10、劑量組相比，在對CD86分子表達(dá)上，PL-PS高、中劑量組比同劑量組的PLP強(p<0.05)，在對CD80的影響的表達(dá)上，PL-PS低劑量組比同劑量組的PLP強(p<0.05)?？瞻捉MDCs吞噬FITC標(biāo)記的葡聚糖功能很強，而經(jīng)不同劑量PL-PS，PLP處理后DCs的吞噬活性均明顯下降。再次提示大粒車前子多糖可促進小鼠骨髓來源DCs表型及功能的成熟，并且這一促進功能在10～200μg/mL濃度范圍內(nèi)，呈劑量依賴關(guān)系。 5.探討

11、了不同劑量大粒車前子多糖PL-PS及PLP對DCs分泌功能的影響。采用Griess法檢測各組DCs分泌NO的量；雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清中細(xì)胞因子IL-12p70、IL-10、IL-1β及趨化因子RANTES的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PL-PS及PLP能夠誘導(dǎo)未成熟DCs分泌Th1型細(xì)胞因子IL-12p70和IL-1β，對Th2型細(xì)胞因子11.10則具有顯著抑制作用(p<0.05)，并且這種刺激作用具有劑量依

12、賴性，與同劑量的PLP相比，25pg/mL PL-PS可顯著降低IL-10的產(chǎn)生(p<0.05)。PL-PS及PLP能夠刺激未成熟DCs分泌RANTES-Thl型趨化因子，而且這種促進作用在PL-PS濃度為25μg/mL時最顯著(p<0.05)。由此可見，PL-PS及PLP可以通過調(diào)節(jié)DCs分泌不同類型的細(xì)胞因子及趨化因子，誘導(dǎo)機體偏向Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答，以及促進機體天然免疫向獲得性免疫過渡。 6.探討了不同劑量大粒車前子多糖

13、PL-PS及PLP對DCs刺激T細(xì)胞功能的影響。采用MTT法檢測PL-PS及PLP對DCs刺激OVA未致敏或致敏淋巴細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)PL-PS和PLP均可增強樹突狀細(xì)胞的刺激未致敏和致敏淋巴細(xì)胞增殖的能力，說明經(jīng)PL-PS或PLP刺激后，樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)免疫應(yīng)答及抗原提呈功能，均增強。提示在適宜的T:DCs比時，PL-PS與PLP的作用一致，均能促進DCs對T細(xì)胞增殖的刺激作用。 7.探討了不同劑量大粒車前子多糖PL-PS及P

14、LP對DCs趨化功能的影響。采用半定量PCR法檢測了DCs表面趨化因子受體CCR7 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PL-PS或PLP均可影響DCs表面趨化因子受體CCR7的表達(dá)。其中，與陰性對照相比，PL-PS在濃度為100μg/mL，PLP在濃度為50μg/mL和100μg/mL時，可顯著提高DCs表面CCR7的表達(dá)(p<0.01)?？梢酝茰yPLP或PL-PS對DCs的促成熟作用可能與趨化因子受體的表達(dá)有關(guān)。 8.初步探討了大粒

15、車前子多糖對DCs抗小鼠SP2/0骨髓瘤功能的影響。選取小鼠骨髓瘤細(xì)胞制備凍融抗原，使小鼠骨髓來源DCs負(fù)載SP2/0細(xì)胞凍融抗原，致敏T淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生CTL，誘導(dǎo)出的T淋巴細(xì)胞對SP2/0細(xì)胞有明顯CTL活性，而PL-PS及PLP的干預(yù)可促進這一功能的提高。所以大粒車前子多糖抗腫瘤機制與促進DCs抗原呈遞能力有密切的關(guān)系，可提高機體對腫瘤細(xì)胞的特異性主動免疫功能。 9.探討了大粒車前子多糖對小鼠巨噬細(xì)胞功能的影響。采用倒置顯微

16、鏡、MTT法、Griess法、流式細(xì)胞術(shù)及ELISA法探討了大粒車前子多糖對RAW264.7細(xì)胞株及小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：PL-PS能刺激RAW264.7細(xì)胞株和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞生成NO；促進RAW264.7細(xì)胞表面CD80、CD86、CD40的表達(dá)及TNF-α、IL-1β的分泌，并能促進腹腔巨噬細(xì)胞IL-10的分泌。提示大粒車前子多糖的免疫調(diào)節(jié)活性也與其對巨噬細(xì)胞的作用相關(guān)。。 上述結(jié)果提示：植物化學(xué)物的免疫調(diào)節(jié)可

17、通過建立的以小鼠骨髓來源DCs為靶細(xì)胞的模型來進行初步的篩選和探討。大粒車前子多糖PL-PS及PLP可通過促進DCs表面MHC II類分子，共刺激分子的表達(dá)及Th1型細(xì)胞因子的分泌，刺激T淋巴細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答并增強CTL對腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷活力。并通過促進DCs表面趨化因子受體CCR7 mRNA的表達(dá)，促進DCs的移行和發(fā)育成熟。說明PL-PS及PLP均作用于DCs，通過對DCs移行、成熟、功能的上調(diào)作用而促進免疫應(yīng)答