楊梅素及楊梅提取液對(duì)體外人黑素細(xì)胞黑素體生成和轉(zhuǎn)運(yùn)的作用.pdf

1、[目的]
　　楊梅中含有多種黃酮類化合物，從楊梅中分離、提純得到的黃酮類化合物楊梅素(Myricetin，MYR)。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化性、消除體內(nèi)自由基、抗癌防癌、抗菌抗病毒、抗炎、防止血小板聚集等多種生物活性。但其對(duì)正常人黑素細(xì)胞的影響卻鮮有報(bào)道。在黑素運(yùn)輸阻斷劑的篩選中，我們發(fā)現(xiàn)楊梅素能夠誘導(dǎo)正常人表皮黑素細(xì)胞的形態(tài)變化，抑制黑素細(xì)胞樹(shù)突延伸。黑素在黑素細(xì)胞內(nèi)合成后，經(jīng)由黑素細(xì)胞樹(shù)突分泌入周邊角質(zhì)化細(xì)胞內(nèi)，形成皮膚色素并保

2、護(hù)機(jī)體免受紫外線損傷，因此黑素轉(zhuǎn)運(yùn)率是影響膚色的重要因素。此過(guò)程受樹(shù)突長(zhǎng)短、樹(shù)突分叉的數(shù)量及胞內(nèi)外環(huán)境的影響。本研究旨在評(píng)價(jià)楊梅單體楊梅素及楊梅提取液對(duì)正常人表皮黑素細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)和增殖的影響，并闡明楊梅單體楊梅素及楊梅提取液對(duì)于人表皮黑素細(xì)胞黑素體合成與轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用。
　　[方法]
　　采用M254黑素細(xì)胞培養(yǎng)基及添加劑HMGS培養(yǎng)和純化人表皮黑素細(xì)胞；使用原子吸收光譜法測(cè)定新鮮楊梅的成分；醇提取法提取楊梅的活性成分；

3、觀察楊梅素及楊梅提取液對(duì)正常人黑素細(xì)胞的增殖和黑色素生成方面的調(diào)節(jié)作用；分別采用常規(guī)制樣方法和以PET聚酯薄膜為培養(yǎng)細(xì)胞的支持物制備透射電鏡樣本，并通過(guò)透射電鏡觀察楊梅素及楊梅提取液對(duì)黑素細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響；激光共聚焦顯微鏡觀察楊梅素及楊梅提取液對(duì)黑素細(xì)胞相關(guān)蛋白Tyrosinase，TRP-1，Myosin Va和β-actin的表達(dá)的變化；實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Tyrosinase，TRP-1，Myosin Va和Rab27a在基因水平

4、上的表達(dá)的變化。
　　[結(jié)果]
　　1.本研究成功分離及純化了人表皮黑素細(xì)胞，完善了人表皮黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)條件。
　　2.原子吸收光譜方法測(cè)定楊梅的化學(xué)元素含量。
　　3.楊梅素對(duì)黑素細(xì)胞的增殖和黑素合成有一定的抑制作用；楊梅素作用組黑素細(xì)胞樹(shù)突明顯變短，樹(shù)突分叉減少，且呈濃度依賴性。楊梅提取液對(duì)黑素細(xì)胞樹(shù)突增生有一定的促進(jìn)作用。
　　4.人表皮黑素細(xì)胞透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，常規(guī)制樣標(biāo)本可觀察人表皮黑素細(xì)胞及其

5、樹(shù)狀突起橫切面的超微結(jié)構(gòu)。PET聚酯薄膜作為培養(yǎng)黑素細(xì)胞支持物的樣本可觀察人表皮黑素細(xì)胞和樹(shù)狀突起的完整超微結(jié)構(gòu)及樹(shù)狀突起的縱切面超微結(jié)構(gòu)。
　　5.透射電鏡結(jié)果顯示，Control組黑素細(xì)胞細(xì)胞核周?chē)休^多的線粒體和Ⅰ、Ⅱ期黑素體，較多黑化的Ⅲ、Ⅳ期黑素體靠近細(xì)胞膜分布。50μM楊梅素作用48 h后黑素細(xì)胞細(xì)胞核周?chē)休^多的線粒體和Ⅰ、Ⅱ期黑素體，僅有少量黑化的Ⅲ、Ⅳ期黑素體散在分布于細(xì)胞中。與Control組黑素細(xì)胞相比，楊梅

6、提取液組黑素細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯變化。
　　6.激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Control組黑素細(xì)胞Tyrosinase和TRP-1蛋白在樹(shù)突頂端高表達(dá)；50μM楊梅素組，Tyrosinase和TRP-1蛋白在細(xì)胞內(nèi)散在分布，與Control相比，Myosin Va蛋白在黑素細(xì)胞內(nèi)表達(dá)下降。楊梅提取液組與Control組相比，黑素細(xì)胞內(nèi)Myosin Va蛋白的表達(dá)無(wú)明顯變化。
　　7.實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著楊梅素作用濃度的

7、增加，Tyrosinase、TRP-1、Myosin Va和Rab27a mRNA的表達(dá)呈先激活后抑制作用。50μM楊梅提取液時(shí)作用黑素細(xì)胞48 h后，Tyrosinase和Rab27a mRNA的表達(dá)呈被抑制作用。
　　[結(jié)論]
　　1.成功建立了體外原代培養(yǎng)的人表皮黑素細(xì)胞模型。
　　2.0～100μM楊梅素可誘導(dǎo)黑素細(xì)胞形態(tài)明顯改變和抑制黑素細(xì)胞中黑素的合成，并且對(duì)黑素細(xì)胞無(wú)毒性。0～400μM楊梅提取液對(duì)黑素細(xì)

8、胞無(wú)毒性。
　　3. PET聚酯薄膜可作為人表皮黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)良好的支持材料。應(yīng)用不同樣本制備方法可以觀察黑素細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，使用PET聚酯薄膜作為細(xì)胞支持物制備的標(biāo)本更利于黑素細(xì)胞黑素體代謝和轉(zhuǎn)移的觀察。
　　4.電鏡觀察結(jié)果顯示，楊梅素作用組黑素細(xì)胞黑素體的轉(zhuǎn)運(yùn)被抑制，黑素化程度降低。而楊梅提取液組黑素細(xì)胞無(wú)明顯變化。
　　5.激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示楊梅素作用組黑素細(xì)胞Tyrosinase和TRP-1蛋白定