MicroRNAs在橘小實蠅精子發(fā)育中的作用研究.pdf

1、橘小實蠅是廣泛分布于東亞和太平洋地區(qū)的最重要的園藝害蟲之一。在其防治策略中，雄性不育技術(shù)(SIT)具有高特異、環(huán)境友好的巨大優(yōu)勢，然而傳統(tǒng)的SIT依賴于輻照和化學(xué)不育劑，容易損傷不育雄蟲的交配競爭力，從而限制了其防治效果。近年來，基于遺傳改造的SIT在橄欖實蠅的防治中表現(xiàn)優(yōu)異，顯示了在實蠅防治應(yīng)用中的巨大潛力。另一方面，microRNAs(miRNAs)作為一種負向調(diào)控目標基因表達的關(guān)鍵性的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，參與調(diào)控了各種生命過程，其中就

2、包括對精子發(fā)生的調(diào)控。因此，基于精子發(fā)生關(guān)鍵miRNA的遺傳改造技術(shù)對于SIT具有重要的開發(fā)價值。然而到目前為止，橘小實蠅中精子發(fā)生調(diào)控相關(guān)miRNA的研究還很缺乏。
　　本研究首先對性成熟期(FM)、初羽化（IM）、生殖前期(MA)橘小實蠅的精巢組織small RNA進行了深度測序，并整合構(gòu)建了總small RNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，預(yù)測了172個已知和78個未知的miRNA，并分析了它們在精子發(fā)生過程中的表達動態(tài)。然后，通過對三個發(fā)

3、育時期精巢組織small RNA轉(zhuǎn)錄譜進行兩兩比較，分別發(fā)現(xiàn)了在FM與IM、FM與MA、IM與MA發(fā)育時期之間差異表達的24、15、14個精巢miRNA。通過生物信息學(xué)分析，進一步預(yù)測了13個轉(zhuǎn)錄差異最大的miRNA的124個靶標基因，并從中隨機選擇了6個miRNA和其預(yù)測調(diào)控的基因進行qRT-PCR驗證分析，發(fā)現(xiàn)有4個miRNA與其靶標基因的轉(zhuǎn)錄模式相反。
　　進一步的，對這4個miRNA中的miR-8-3p調(diào)控精子發(fā)生的功能進

4、行了深入研究。首先，我們預(yù)測出miR-8-3p的靶標基因，B.dorsalis mitoferrin(bmfrn)，推測miR-8-3p通過負調(diào)控bmfrn來調(diào)節(jié)精子發(fā)生。接下來，我們通過HeLa細胞的dual-luciferase報告系統(tǒng)驗證了miR-8-3p通過結(jié)合bmfrn的3' UTR區(qū)抑制后者的表達。而且，miR-8-3p的類似物(antagomiR)或bmfrn的dsRNA注射處理都能顯著抑制mitoferrin的轉(zhuǎn)錄，減少