PGRP-LB和PGRP-SB基因在橘小實(shí)蠅免疫及腸道微生物調(diào)控中的作用研究.pdf

1、橘小實(shí)蠅Bactrocera dorsalis(Hendel)是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲，主要以幼蟲潛食為害。橘小實(shí)蠅的寄主十分廣泛，可危害柑桔、瓜類等多種水果、蔬菜和花卉。腸道微生物與昆蟲本身密切相關(guān)，影響著宿主很多生理功能，如營(yíng)養(yǎng)代謝、免疫等方面。本研究采用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆獲得基因PGRP-LB和PGRP-SB的ORF框序列，并通過(guò)注射和喂食大腸桿菌Escherichia coli研究橘小實(shí)蠅上述基因?qū)l件致病菌的免疫響應(yīng);

2、通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默基因PGRP-LB和PGRP-S，分析橘小實(shí)蠅的免疫響應(yīng)及腸道微生物群落的變化，闡述這些基因在橘小實(shí)蠅免疫和腸道微生物穩(wěn)態(tài)維持中的作用，以期為橘小實(shí)蠅的綜合防治提供一種全新的防控思路和作用靶標(biāo)。
　　1 PGRP-LB和PGRP-SB基因的克隆與表達(dá)模式
　　從NCBI獲得橘小實(shí)蠅PGRP-LB基因ORF框的核苷酸序列長(zhǎng)度為738bp，成功克隆到橘小實(shí)蠅PGRP-S基因ORF框的核苷酸序列，其長(zhǎng)度為55

3、8bp。序列分析表明兩個(gè)基因均與地中海實(shí)蠅相應(yīng)基因序列的同源性最高，分別為86％和91％。表達(dá)模式結(jié)果表明PGRP-LB基因在橘小實(shí)蠅成蟲中腸中表達(dá)量最高，其次在成蟲脂肪體中表達(dá)量也較高，PGRP-SB基因主要在三齡幼蟲和性成熟成蟲脂肪體中表達(dá)。
　　2 PGRP-LB和PGRP-SB基因?qū)l件致病菌感染的免疫響應(yīng)
　　通過(guò)對(duì)橘小實(shí)蠅注射或喂食感染條件致病菌E.coli后，Imd信號(hào)通路中的抗菌肽基因Diptericin的表

4、達(dá)量顯著增加，注射E.coli后6h反應(yīng)最強(qiáng)烈，Diptericin的表達(dá)量上調(diào)了6.40倍，喂食E.coli后12h反應(yīng)最強(qiáng)烈，Diptericin的表達(dá)量上調(diào)了4.52倍;同時(shí)PGRP-LB和PGRP-SB基因表達(dá)水平明顯上調(diào)，注射菌液后6h PGRP-LB基因表達(dá)量上調(diào)2.97倍，注射菌液后24h PGRP-SB基因表達(dá)量上調(diào)1.61倍;喂食菌液后12h PGRP-LB和PGRP-S基因反應(yīng)均最強(qiáng)烈，表達(dá)量分別比對(duì)照組上調(diào)了54.

5、32％和30.26％。但注射感染比喂食感染引起的體液免疫反應(yīng)更為強(qiáng)烈迅速。這些結(jié)果表明E.coli能啟動(dòng)橘小實(shí)蠅系統(tǒng)及腸道Imd信號(hào)通路的免疫反應(yīng)，且抗菌肽基因Diptericin與PGRP-LB和PGRP-SB基因在免疫防御過(guò)程中起著重要作用。
　　3 PGRP-LB和PGRP-SB基因?qū)﹂傩?shí)蠅免疫反應(yīng)的影響
　　通過(guò)干擾PGRP-LB和PGRP-SB基因后注射或喂食E.coli研究PGRP-LB和PGRP-SB基因在橘

6、小實(shí)蠅免疫中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，沉默PGRP-LB和PGRP-SB基因的橘小實(shí)蠅在注射或喂食感染E.coli后，其抗菌肽基因Diptericin的表達(dá)量與對(duì)照組相比均顯著上調(diào)，免疫反應(yīng)增強(qiáng)且免疫反應(yīng)持續(xù)時(shí)間增長(zhǎng)。以上結(jié)果說(shuō)明PGRP-LB和PGRP-SB基因能抑制橘小實(shí)蠅腸道免疫系統(tǒng)過(guò)激的免疫反應(yīng)，起到免疫負(fù)調(diào)控作用。
　　4 PGRP-LB和PGRP-SB基因沉默對(duì)橘小實(shí)蠅腸道微生物群落的影響
　　通過(guò)PGRP-LB和PGR

7、P-SB基因的RNAi，研究PGRP-LB和PGRP-SB基因在橘小實(shí)蠅腸道內(nèi)共生菌群落穩(wěn)態(tài)維持中的作用。Real-time PCR結(jié)果表明，干擾后5天內(nèi)PGRP-LB和PGRP-S基因表達(dá)量都處于下調(diào)狀態(tài)，第15天時(shí)基因表達(dá)量恢復(fù)正常，與對(duì)照組表達(dá)量無(wú)顯著差異。同時(shí)分別于第5、15、20天檢測(cè)腸道微生物群落變化，結(jié)果表明PGRP-LB基因干擾后第5天腸道內(nèi)總細(xì)菌數(shù)量、γ-變形菌門(γ-Proteobacteria)、放線菌門(Acti

8、nobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)細(xì)菌分別下調(diào)18.78％、56.67％、61.98％和67.46％;PGRP-SB基因干擾后第5天腸道內(nèi)總細(xì)菌數(shù)量、α-變形菌門(α-Proteobacteria)、γ-變形菌門(γ-Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)分別下調(diào)31.73％、40.41％、44.64％、50

9、.26％、52.19％和70.18％。PGRP-LB基因干擾后第15天腸道內(nèi)總細(xì)菌數(shù)量、α-變形菌門(α-Proteobacteria)、γ-變形菌門(γ-Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)細(xì)菌分別上調(diào)2.16倍、1.04倍、1.65倍、0.38倍、2.70倍、0.84倍。PGRP-SB基因干擾后第15天腸道內(nèi)總細(xì)菌數(shù)量和放線

10、菌門(Actinobacteria)細(xì)菌無(wú)顯著變化，α-變形菌門(α-Proteobacteria)、γ-變形菌門(γ-Proteobacteria)細(xì)菌分別上調(diào)53.77％和60.48％，擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門（Firmicutes）細(xì)菌分別下調(diào)14.89％和63.60％。PGRP-LB基因干擾后第20天腸道內(nèi)總的細(xì)菌和五個(gè)門的細(xì)菌數(shù)量均恢復(fù)到正常水平。PGRP-SB基因干擾后第20天腸道內(nèi)總的細(xì)菌和γ-變形