EBV反式激活因子Zta和Rta促進Raji細胞從G-,0--G-,1-期到S期的轉(zhuǎn)變.pdf

1、近年來已經(jīng)比較清楚的是小DNA病毒，如猿猴病毒40（SV40）或乳頭瘤病毒與細胞周期相互影響，在病毒進入復(fù)制裂解期的同時，促進細胞周期進入S期，這些病毒不能編碼DNA復(fù)制時所需要的聚合酶或其它輔助因子，所以就改變或利用細胞周期調(diào)控機制，支持病毒DNA的復(fù)制。而皰疹病毒類如EB病毒，有一套能編碼病毒DNA聚合酶及其輔助因子的基因體系，復(fù)制系統(tǒng)相對獨立，與猿猴病毒40或乳頭瘤病毒不同，皰疹病毒并不需要S期的環(huán)境支持病毒復(fù)制。皰疹病毒家族不同

2、成員間這種功能的保守性表明，這是皰疹病毒復(fù)制策略的組成部分。此外，皰疹病毒裂解復(fù)制過程對細胞周期的調(diào)控也涉及到一系列病毒蛋白，進一步揭示了這種功能在病毒生命周期的重要作用。
　　 EB病毒（Epstein-BarrVirus，EBV）是具有嗜B細胞特性的γ皰疹病毒類，人群中造成最廣泛感染的病毒種類之一。研究表明，90～95％以上的不同人種均有EBV感染史，大量的臨床研究表明，EBV與多種惡性腫瘤如Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌、胃

3、癌等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。此外，EBV感染帶來的嚴重問題尚包括移植后淋巴增殖性疾?。╬ost-transplantlymphoproliferativedisease，PTLD）。EBV主要感染人B細胞和上皮細胞，EBV在宿主細胞中以兩種形式存在：潛伏期和裂解期。EBV在其生命周期中使用兩組相對獨立的基因執(zhí)行不同的功能，在宿主細胞內(nèi)，潛伏期基因通過激活細胞周期進程導(dǎo)致細胞無限增殖，這也解釋了在EBV感染導(dǎo)致的腫瘤中總是能發(fā)現(xiàn)潛伏期基因的表

4、達。潛伏期蛋白表達與細胞周期進展的關(guān)系已經(jīng)確立，但是裂解期蛋白與細胞周期的關(guān)系仍然不清楚。
　　 研究表明，與潛伏期蛋白表達環(huán)境不同，裂解復(fù)制過程更依賴于EBV編碼的立早蛋白。當被重新激活時，EB病毒立早（IE）裂解基因BZLF1和BRLF1開始表達。這些基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子會激活病毒和胞內(nèi)基因的啟動子，結(jié)果導(dǎo)致下游基因瀑布式的激活包括早期基因、病毒基因組以及晚期基因。裂解復(fù)制周期更可能與非增值的細胞環(huán)境有關(guān)，比如在口腔上皮細胞，

5、裂解復(fù)制主要發(fā)生在分化良好的外層。但是，在這個系統(tǒng)中，很難確定是細胞生長分化信號導(dǎo)致了病毒的裂解復(fù)制還是病毒的裂解復(fù)制影響了細胞周期進程。但有研究表明EB病毒裂解基因產(chǎn)物Zta可誘導(dǎo)細胞周期停滯，并已經(jīng)形成關(guān)閉宿主細胞DNA復(fù)制的機制，然而EBV裂解周期過程調(diào)控細胞周期的機制尚不明確。綜上所述，本研究旨在探索EBV裂解期蛋白與宿主細胞周期的關(guān)系及其調(diào)控細胞周期的機制。
　　 我們利用B淋巴瘤細胞系Raji細胞作為本研究的主要模型

6、細胞，應(yīng)用TPA/NaB誘導(dǎo)Raji細胞中的EBV進入裂解期，觀察到處于潛伏期感染的細胞出現(xiàn)生長阻滯和周期改變，Zta表達的陽性細胞主要富集在細胞周期G0/G1期，當Zta的表達達到最大程度時，Zta陽性細胞群部分重新進入了S期。然而這種方法對分析單純EBV裂解期與宿主細胞的胞內(nèi)活動不太嚴格，因為這很難區(qū)分是EBV裂解基因的影響還是化學(xué)誘導(dǎo)的作用，例如我們觀察到在EBV立早蛋白Zta表達前就出現(xiàn)了部分細胞G2/M期的阻滯。因此我們構(gòu)建了

7、Zta和Rta的真核表達載體，轉(zhuǎn)染表達后他們能有效激活EBV裂解期，對細胞周期的影響與誘導(dǎo)后的變化是一致的。通過對一系列細胞周期調(diào)控蛋白的分析揭示了Raji細胞中Zta和Rta的表達干擾了細胞周期的調(diào)控機制，Zta和Rta的表達明顯下調(diào)了Rb和p53的表達而上調(diào)了E2目的表達，進一步分析了Rb的下調(diào)與其蛋白酶體降解途徑有關(guān)，而對p53和p21的調(diào)節(jié)表現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平上，結(jié)果提示：Zta和Rta的表達促進了Raji細胞S期的進程，并且進一步揭