牛流行熱病毒糖蛋白G-,1-抗原表位的表達(dá)及重組G-,1-蛋白抗原間接ELISA方法的建立.pdf

1、牛流行熱 (bovine ephemeral fever,BEF) 是由牛流行熱病毒 (bovine ephemeralfever virus,BEFv) 引起的一種急性傳染病,首先發(fā)現(xiàn)于19世紀(jì)中期的東非,隨后流行于非洲、亞洲和大洋洲許多國(guó)家和地區(qū).該病傳播迅速,流行面廣,有一定的周期性,曾在我國(guó)多個(gè)省份多次發(fā)生,導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量降低,乳品質(zhì)下降,役用牛跛行或癱瘓,部分懷孕母牛流產(chǎn),給養(yǎng)牛業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失.BEFV有5種結(jié)構(gòu)蛋白,其中

2、G蛋白是主要的免疫原性蛋白,其表面存在5個(gè)抗原位點(diǎn),G<,1>為BEFV所特有,只與牛流行熱病毒陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng),而其它位點(diǎn)與同科的相關(guān)病毒則存在交叉反應(yīng),因此我們選取G<,1>抗原表位進(jìn)行克隆表達(dá)利蛋白純化.將得到的重組G<,1>蛋白作為包被抗原,建立檢測(cè)BEF血清抗體的間接ELISA方法,開發(fā)相關(guān)的試劑盒,為該病的快速診斷和疫苗免疫后的抗體水平監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支持. 本文從BEF中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)毒株JB76H株中提取總RNA,通過RT-

3、PCR方法擴(kuò)增G<,1>抗原表位目的基因.序列分析發(fā)現(xiàn),克隆的G<,1>抗原表位基因與NCBI/GenBank上登載的臺(tái)灣株的核苷酸同源性為96.4﹪,氨基酸同源性為96.5﹪;與澳大利亞株的核苷酸同源性為89.1﹪,氨基酸同源性為90.8﹪.目的基因在GS115中得到胞外分泌的可溶性目的蛋白,蛋白大小約為26.0kDa;在BL21(DE3)中得到主要以包涵體形式存在的重組蛋白,蛋白大小約為41.54kDa.經(jīng)SDS-PAGE、West

4、ern blot、ELISA、兔體免疫實(shí)驗(yàn)和特異性分析,兩種蛋白均具有良好的反應(yīng)原性、免疫原性和特異性,可作為包被抗原,建立ELISA方法. 本文以BL21(DE3)表達(dá)的重組蛋白作為包被抗原,經(jīng)過各種反應(yīng)條件的優(yōu)化,建立了檢測(cè)BEFV血清抗體的間接 ELISA方法.本研究表明,抗原的最適包被濃度為0.574μg/孔;血清和酶標(biāo)抗體的最佳稀釋度分別為1∶20和 1∶200;抗原包被后以37℃1h轉(zhuǎn)入4℃過夜包被效果較好;封閉后以

5、37℃1h、血清加入后以37℃1h、酶標(biāo)抗體加入后以37℃1h反應(yīng),為ELISA最適反應(yīng)溫度和間隔時(shí)間.判定標(biāo)準(zhǔn)為:標(biāo)準(zhǔn)陰性血清對(duì)照孔OD<,490>值的平均值×2.1作為閾值,所測(cè)樣品的OD<,490>值大于或等于閾值判為陽(yáng)性,小于閾值判為陰性.該法有良好的敏感性、特異性和重復(fù)性,有臨床實(shí)用價(jià)值.在畢赤酵母GS115中表達(dá)的可溶性目的蛋白作為包被抗原,也建立了間接ELISA方法.該方法敏感性和重復(fù)性較好,但特異性和符合性較差,其根本原