致病性鵝新城疫病毒的分離鑒定及分子流行病學(xué)特征.pdf

1、新城疫(Newcastle Disease，ND)是由新城疫病毒引起的一種急性、高度接觸l生禽類傳染病，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)定為A類傳染病。新城疫病毒(NDV)屬于副黏病毒科、副黏病毒亞科、腮腺炎病毒屬，有囊膜的負(fù)鏈RNA病毒，可存在于病禽的所有組織器官、體液、分泌物和排泄物中。水禽一直被認(rèn)為是NDV的自然貯存庫(kù)，鵝、鴨等能攜帶NDV，但通常不表現(xiàn)任何臨診癥狀，甚至對(duì)NDV強(qiáng)毒株具有堅(jiān)強(qiáng)的抵抗力。但1997年以來(lái)，我國(guó)華南和華東

2、地區(qū)發(fā)生了NDV導(dǎo)致的鵝的臨診疾病，目前鵝源ND已在我國(guó)大部分地區(qū)呈現(xiàn)流行趨勢(shì)，嚴(yán)重影響我國(guó)養(yǎng)鵝業(yè)的健康發(fā)展。由于NDV具有很高的變異能力，對(duì)其分子流行病學(xué)進(jìn)行研究，有助于掌握NDV的變異情況，分析預(yù)測(cè)ND的流行趨勢(shì)，可為制定有效的預(yù)防措施提供可靠的理論基礎(chǔ)。 本研究在2005～2006年間從江蘇省不同地區(qū)的發(fā)病鵝群分離、鑒定了8株NDV，其代號(hào)分別為JS/I/05/Go、JS/2/05/Go、JS/3/05/Go、JS/4/0

3、5/Go、JS/5/06/Go、JS/6/06/Go、JS/7/06/Go、JS/8/05/Go，這些毒株經(jīng)雞胚終點(diǎn)稀釋法克隆純化后，測(cè)定了雞胚平均死亡時(shí)間(MDT)和1日齡雛雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)(ICPI)，8株病毒的MDT為50．4～60 h，ICPI為1.75～1.91，被判定為NDV強(qiáng)毒株。 用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增NDV F基因的部分片段，經(jīng)克隆、測(cè)序獲得了8株鵝NDV F基因的部分(5’端1700個(gè)核苷酸(nt))序列，

4、分析測(cè)定的序列及推導(dǎo)的相應(yīng)氨基酸序列。結(jié)果表明，8株鵝。NDV F蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)中，含有6個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)和12個(gè)半胱氨酸殘基，F(xiàn)蛋白前體FO裂解位點(diǎn)附近的氨基酸序列均為<'112>R-R-Q-K-R-F<'117>，符合NDV強(qiáng)毒株的特征；8株病毒中除JS/2/05/Go株外，其余7株病毒F基因的核苷酸同源性為97．5％～99．8％，對(duì)應(yīng)的氨基酸序列的同源性為97．8％～99．8％，而JS/2/05/Go株與這7株病毒F基因核苷酸的同

5、源性為86.3％～86.9％，對(duì)應(yīng)的氨基酸序列的同源性為90.4％～91.1％；8株病毒與國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株F<,48>E<,8>F基因核苷酸的同源性為86.9％～92.3％。對(duì)應(yīng)的氨基酸序列的同源性91.3％～94.2％；除JS/2/05/Go株外，7株病毒與1997以來(lái)國(guó)內(nèi)分離到的對(duì)鵝具有高度致病性的NDV相應(yīng)核苷酸和氨基酸序列的同源性均大于97％，而JS/2/05/Go株病毒與其核苷酸的同源性最高為87.6％，氨基酸同源性為90％左右

6、；8株病毒與2003-2004年間從表征健康鵝群中分離的6株NDV的核苷酸同源性為84.2％～88.6％，氨基酸同源性為88％～89.8％。以F基因高變區(qū)374nt片段(第47～420nt)為基礎(chǔ)，用軟件繪制遺傳發(fā)生樹(shù)，結(jié)合對(duì)F基因第334～1682nt之間3種限制性內(nèi)切酶HinfI、BstO I和Rsa I酶切位點(diǎn)的分析，結(jié)果表明，7個(gè)毒株與近年來(lái)分離自發(fā)病鵝群的部分VIId亞型毒株位于同一個(gè)分支內(nèi)，將其歸入基因Ⅶd亞型，JS/2/0

7、5/Go則與毒株AIJS/32位于同一分支內(nèi)，將其歸入基因Ⅲ型。 本研究分離的病毒中有7株病毒F蛋白第52、71、176、272、314、402及489位出現(xiàn)了7個(gè)特征性的氨基酸變化，其中第176、272及489位氨基酸的變化，分別處于與F蛋白功能密切相關(guān)的3個(gè)七肽重復(fù)序列(HRl、HR2、HR3)內(nèi)；1996年以來(lái)國(guó)內(nèi)部分雞源分離株在上述位點(diǎn)中的部分位點(diǎn)已經(jīng)具有和鵝NDV相同的氨基酸。 用RT-PCR技術(shù)對(duì)8株病毒的H

8、N基因部分片段進(jìn)行擴(kuò)增、克隆、測(cè)序。結(jié)果本研究測(cè)定的8株病毒HN基因編碼區(qū)長(zhǎng)1716nt，可編碼571個(gè)氨基酸，分析編碼區(qū)序列及由其推導(dǎo)的氨基酸序列，并與近年來(lái)流行的鵝源與雞源NDV的相應(yīng)序列進(jìn)行比較。結(jié)果表明，8株鵝NDV HN基因編碼區(qū)核苷酸同源性為96.4％～99.7％，對(duì)應(yīng)的氨基酸同源性為94.9％～99.7％。與NDV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株F<,48>E<,8>HN基因核苷酸同源性為80.7％～81.8％，對(duì)應(yīng)的氨基酸同源性為84.4％～

9、87.6％；與近年來(lái)分離的部分致病性鵝源和雞源NDV HN基因核苷酸同源性大于95％，對(duì)應(yīng)的氨基酸同源性大于96％。 在推導(dǎo)的HN蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列中，8株病毒含有13個(gè)保守的半胱氨酸殘基及5個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)。鵝NDV HN蛋白細(xì)胞受體結(jié)合相關(guān)區(qū)域的氨基酸序列與雞源NDV無(wú)明顯差異。但在第48、54、77、266、340及384位出現(xiàn)了6個(gè)特征性的氨基酸變化，其中有6株病毒的第48位的氨基酸殘基仍為M，與部分雞源毒株相同