貴州新城疫分子流行病學(xué)調(diào)查及熒光RT-PCR方法的檢測.pdf

1、新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的極易傳染的毀滅性疾病。NDV屬于副粘病毒科，副粘病毒亞科，腮腺炎病毒屬。由于該病發(fā)病急、致死率高，對養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，所以被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)定為A類烈性傳染病。長期以來，我國普遍開展了以接種疫苗為主的新城疫綜合防制措施，使得ND的暴發(fā)得以控制，但近年來，ND的流行又出現(xiàn)新的特點(diǎn)：不表現(xiàn)特異性癥狀的ND病例日益增多，甚至于高抗體雞群也發(fā)生該??；許多學(xué)者認(rèn)為這些流行特點(diǎn)表明很可

2、能是由變異或超強(qiáng)毒株引起。特別是近年來鵝源病毒新城疫變異株的出現(xiàn)，更引起人們對于非典型新城疫發(fā)病原因的興趣。 本研究通過RT-PCR法對1999至2004年間分離自貴州省的具有一定代表性的8株新城疫病毒。擴(kuò)增出其F基因，并與國內(nèi)外已發(fā)表各新城疫代表株進(jìn)行同源性比較。為探討新城疫是否發(fā)生變異提供理論依據(jù)。為貴州省的NDV分子流行病學(xué)研究提供有益參考，豐富我國新城疫分子流行病學(xué)特征，為制定控制新城疫方法提供重要依據(jù)。目前檢測NDV的

3、方法有血凝和血凝抑制試驗(yàn)、病毒分離法、免疫熒光試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等.這些方法有的存在費(fèi)時(shí)、有的存在敏感性不高或特異性不強(qiáng)等缺點(diǎn)。而普通RT-PCR方法可以快速和特異性地檢測很少拷貝的NDV的核酸，因此可以用于NDV的檢測。但其難以控制核酸污染造成假陽性，熒光RT-PCR是近幾年才發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)。它既具有普通RT-PCR的高度靈敏性，又具有實(shí)時(shí)、快速、能夠避免核酸污染和化學(xué)物污染等優(yōu)點(diǎn)。SYBRGreenI模式的熒光RT-PCR

4、是利用熒光染料SYBRGreenI與DNA雙鏈結(jié)合后釋放熒光的特點(diǎn)而建立的一種應(yīng)用較廣的熒光PCR技術(shù)。SYBRGreenI模式的熒光RT-PCR的優(yōu)點(diǎn)是成本小，不需設(shè)計(jì)探針，只要有相關(guān)的引物就可以進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測，并且適合于高度變異的基因檢測。本研究建立了NDV和其毒力的SYBRGreenI模式的熒光RT-PCR檢測技術(shù)。文章分為三個(gè)部分： 第一部分：新城疫病毒貴州分離株F基因的克隆和序列分析根據(jù)GenBank中登錄的新城疫病毒(

5、NDV)F基因序列設(shè)計(jì)了1對引物，用RT-PCR方法擴(kuò)增了8個(gè)貴州分離株的F基因片段，并將其分別克隆到pMD-18T載體中。序列分析結(jié)果表明，上述分離株F基因長度為1662bp，編碼553個(gè)氨基酸，核苷酸和氨基酸序列同源性分別為84.0％～99.7％和187.5％～99.3％；但與LaSota、B1及F48E9等常見毒株的氨基酸同源性僅為87.2％～97.7％。F蛋白裂解位點(diǎn)的氨基酸序列分別112R-R-Q-R/K-R-F117(其中P

6、1、H2、N98、DQ、FW、BY、GZ7株為強(qiáng)毒)和112G-R-Q-G-R-L117(TN1株為弱毒)。利用MegAlign軟件繪制NDV的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果表明：4株分離株(P1、H2、N98、DQ)為基因VII型，2株(GZ、TN)為基因II型，2株(FW、BY)為基因IX型。 第二部分：SYBRGreenI熒光RT-PCR方法快速鑒定新城疫病毒毒力為建立快速鑒定新城疫病毒毒力的SYBRGreenI熒光RT-PCR方法

7、，根據(jù)NDV的F蛋白裂解位點(diǎn)附近的序列，自行設(shè)計(jì)一對引物，然后根據(jù)SYBRGreenI模式的熒光RT-PCR方法對8株NDV的RNA擴(kuò)增效率以及擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值的大小來區(qū)分NDV的毒力。同時(shí)對8株NDV進(jìn)行雞胚平均致死時(shí)間(MDT)測定和序列測序測定，實(shí)驗(yàn)表明：熒光RT-PCR方法的檢測結(jié)果和MDT測定的結(jié)果以及序列測序測定的結(jié)果完全一致。三種方法同時(shí)對80份受檢組織樣品進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果為：SYBRGreenI模式的熒光RT-PCR方

8、法檢出率為：強(qiáng)毒：53.75％(43／80)、弱毒：31.25％(25／80)：普通RT-PCR方法檢出率為：強(qiáng)毒：53.75％(43／80)、弱毒：27.50％(22／80)；雞胚接種病毒分離法檢出率為：強(qiáng)毒：53.75％(43／80)、弱毒：35.00％(28／80)。整個(gè)檢測過程只需4h，表明該方法特異、準(zhǔn)確、快速。說明此熒光RT-PCR法可用于NDV毒力檢測。 第三部分：熒光定量RT-PCR檢測雛雞體內(nèi)新城疫強(qiáng)毒的分布規(guī)

9、律新城疫病毒(NDV)強(qiáng)毒H2經(jīng)人工接種和同居感染18日齡雛雞后，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測病毒在雛雞體內(nèi)各組織的動(dòng)態(tài)分布。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：(1)經(jīng)滴鼻、點(diǎn)眼接種雛雞后6h，即可在肺、腦、脾、腎、腸共五種組織中檢出NDV的RNA；12h后所有受檢組織器官均可檢測到NDV的RNA。(2)同居混群感染后6h，未能在各種組織中檢出NDV的RNA，12h后可在肺、腦、脾、腎、腸、肝、共六種組織中檢出NDV的RNA。24h所有受檢組織均能檢出