豬流行性腹瀉病毒流行毒株的分離、鑒定及致病性研究.pdf

1、豬流行性腹瀉(porcine epidemic drarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemicdiarrhea virus，PEDV)引起的一種以腹瀉、嘔吐、脫水和對(duì)哺乳仔豬高致死率為主要特征的急性、高度接觸性的豬腸道傳染病。PEDV可以感染各年齡段的豬，但哺乳仔豬更易感染，其死亡率和發(fā)病率接近100％。1971年該病首次在英國(guó)彼發(fā)現(xiàn)，隨后蔓延至歐洲及亞洲部分國(guó)家。2013年美國(guó)首次報(bào)道了PEDV感染，

2、而后該病迅速蔓延至全國(guó)，造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，從而使得PEDV受到世界各國(guó)的關(guān)注。我國(guó)2010年就曾爆發(fā)過(guò)嚴(yán)重的PED疫情。近年來(lái)，PED的流行更是越來(lái)越廣泛，新的變異株不斷出現(xiàn)，商品化疫苗與流行毒株的抗原性不匹配，免疫效果不佳，從而嚴(yán)重影響著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。鑒于目前對(duì)于新的PEDV流行毒株基因組特征及流行病學(xué)情況還不十分明確，本研究開(kāi)展了以下幾方面的工作，旨在為進(jìn)一步闡明PEDV中國(guó)流行毒株的分子特點(diǎn)、致病性以及篩選新的、有效候選

3、疫苗毒株等奠定基礎(chǔ)。
　　1、對(duì)2016-2017年間我國(guó)6個(gè)省份（甘肅、新疆、陜西、湖南、海南、河南）的仔豬腹瀉情況進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，并采集獲得了134份腹瀉糞便樣品。同時(shí)，成功建立了PEDV TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法。經(jīng)驗(yàn)證，該方法最低檢測(cè)到240copies/μL，并且僅可檢測(cè)出PEDV，表明靈敏度和特異性均良好。同時(shí)，該方法批間重復(fù)和批內(nèi)重復(fù)變異系數(shù)均小于1％，表明該萬(wàn)法重復(fù)性好。利用本研究建立的qP

4、CR檢測(cè)方法和常規(guī)PCR分別對(duì)上述樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，糞便樣品中PEDV和豬嵴病毒(Porcine kobuvirus，PKV)的陽(yáng)性率分別為54.4％(73/134)和17.2％(23/134)，且樣品中未檢測(cè)出豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroententis virus，TGEV)以及豬德?tīng)査跔畈《?Porcine deltacoronavirus，PDCoV)。值得注意的是，本研究首次在海南樣品

5、中檢測(cè)到PEDV感染的存在，其陽(yáng)性率為59.5％(25/42)。
　　2、從73份PEDV陽(yáng)性樣品中分離到了11株P(guān)EDV流行毒株，對(duì)其進(jìn)行了主要抗原S基因的序列測(cè)定，結(jié)果表明，這11株毒株，其核苷酸和氨基酸相似性與經(jīng)典毒株CV777相比分別為93-94％和92-93％，并在S1區(qū)域都出現(xiàn)一處插入(A133)和缺失(G155)以及連續(xù)4個(gè)氨基酸的插入(56NNTN59)。上述結(jié)果提示2016-2017年中國(guó)PEDV流行毒株主要為G

6、2基因型，并且與經(jīng)典疫苗毒株在主要抗原基因S基因區(qū)域存在較大差異。本結(jié)果為了解和掌握2016-2017年我國(guó)PEDV的流行情況及基因多樣性豐富了數(shù)據(jù)。
　　3、對(duì)上述11株P(guān)EDV毒株分別進(jìn)行體外細(xì)胞傳代培養(yǎng)，從中成功分離到一株細(xì)胞適應(yīng)毒株CH/HNPJ/2017(GenbankAccession MF152604)。該毒株在P1代就出現(xiàn)典型細(xì)胞病變（Cytopathic effect，CPE），隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加，病毒滴度逐漸增

7、加并穩(wěn)定在107TCID50/mL以上。通過(guò)免疫熒光方法可以檢測(cè)到呈現(xiàn)綠色熒光的PEDV病毒粒子。電鏡檢測(cè)可觀察到直徑約100nm大小的、近似圓形的病毒粒子，四周有S蛋白所形成的冠狀病毒所特有的、典型的花冠狀纖突。利用特異性引物對(duì)CH/HNPJ/2017毒株的全基因組序列進(jìn)行了擴(kuò)增和測(cè)序，系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示該毒株位于G2b基因型亞群，與AJ1102和CHGD-01毒株親緣關(guān)系較近，而與疫苗株CV777親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。特別值得注意的是