肺癌tumstatin-α3(IV)表達(dá)及其臨床意義研究.pdf

1、目的:tumstatin是由Ⅳ型膠原α3鏈的中間3股螺旋區(qū)域C-端12個氨基酸和非膠原區(qū)1(NC1)232個氨基酸,共244個氨基酸組成。對體外、體內(nèi)新生血管形成和腫瘤移植瘤模型的研究表明重組tumstatin顯著抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、特異性誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,進(jìn)而抑制腫瘤生長。本研究利用Taqman技術(shù),建立熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-RT-PCR)方法,定量檢測肺癌組織中tumstatin/Ⅳ型膠原α3鏈[α3(Ⅳ)]mRNA表

2、達(dá)水平,運用免疫組化和Western-Blot法檢測相應(yīng)組織tumstatin/Ⅳ型膠原α3鏈蛋白表達(dá)水平,評價肺癌患者tumstatin/α3(Ⅳ)基因表達(dá)和蛋白表達(dá)及兩者之間的變化在肺癌發(fā)生發(fā)展中的臨床應(yīng)用價值。
　　方法:①收集已確診的行手術(shù)切除的原發(fā)肺癌患者48例,獲取肺癌組織及癌旁正常組織。②在α3(Ⅳ)基因NC1結(jié)構(gòu)域編碼序列設(shè)計一對引物和一條Taqman探針;優(yōu)化反應(yīng)體系的條件,以不同質(zhì)粒DNA含量為標(biāo)準(zhǔn)品和其循環(huán)閾

3、值(Ct值)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,檢測肺癌組織中α3(Ⅳ)mRNA含量;并對本方法進(jìn)行方法學(xué)評價。③采用蛋白免疫印記(Western-Blot)方法和免疫組化檢測肺癌組織和癌旁組織標(biāo)本中tumstatin/α3(Ⅳ)蛋白表達(dá)水平,進(jìn)一步探討肺癌發(fā)生發(fā)展與其蛋白表達(dá)之間的關(guān)系。④CD31單抗檢測肺癌組織和癌旁組織血管密度MVD,分析tumstatin/α3(Ⅳ)與MVD的相關(guān)性。
　　結(jié)果:成功建立了α3(Ⅳ)基因mRNA表達(dá)實時熒光定量P

4、CR檢測方法,檢測靈敏度為800拷貝/μl;在103～108拷貝/μl之間與Ct值具有很好的線性關(guān)系;PCR擴(kuò)增效率為99.4％;肺癌組織中α3(Ⅳ)mRNA表達(dá)定量檢測發(fā)現(xiàn),48例肺癌患者肺癌組織α3(Ⅳ)mRNA組含量顯著低于癌旁組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),Western-Blot和免疫組化的檢測,肺癌組織中tumstatin/α3(Ⅳ)蛋白表達(dá)下調(diào)/缺失率顯著高于癌旁組織(P<0.01)。臨床監(jiān)測發(fā)現(xiàn)肺癌患者癌組織α3