擬南芥菜ckrc突變體的篩選和分子遺傳學(xué)研究.pdf

1、本工作通過(guò)對(duì)擬南芥T-DNA插入突變體庫(kù)的篩選，得劍一個(gè)對(duì)細(xì)胞分裂素反應(yīng)異常和根失去向地性的突變體 ckrc1 (Cytokinin induced Root Curling1)。遺傳分析證明ckrc1是隱性純合體?；蚩寺『托蛄蟹治鼋Y(jié)果表明該突變基因編碼一蒜氨酸酶類(lèi)似蛋白。蒜氨酸酶是蔥蒜類(lèi)蔬菜含量非常豐富的蛋白，其生化反應(yīng)及組織定位已經(jīng)比較清楚。但是，在擬南芥中同源基因的功能尚未見(jiàn)報(bào)道。本文對(duì)ckrc1的表型作了較深入的研究。

2、 在含細(xì)胞分裂素的MS培養(yǎng)基上，ckrc1 的根生長(zhǎng)明顯比野生型根長(zhǎng)。在含有TDZ的培養(yǎng)基上做組織培養(yǎng)時(shí)，ckrc1 愈傷組織形成的速率、數(shù)量以及外植體愈傷誘導(dǎo)率都明顯低于wt。以上結(jié)果表明 ckrc1 對(duì)細(xì)胞分裂素敏感性下降。其原因可能是i，ckrc1 中細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程受到影響，使得 ckrc1 對(duì)細(xì)胞分裂素不敏感；ii，外源細(xì)胞分裂素引起野生型和ckrc1 的內(nèi)源生長(zhǎng)素的水平下降，但是野生型下降程度更明顯。在含IAA或TIB

3、A的培養(yǎng)基上ckrc1 的表型與野生型一致。 在MS基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天后轉(zhuǎn)移到含細(xì)胞分裂素或TIBA的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)4大，ckrc1 根卷曲生長(zhǎng)，卷曲的方向是隨機(jī)的，而野生型的根垂直生長(zhǎng)。在向地性實(shí)驗(yàn)中，野生型根很快向下彎曲生長(zhǎng)，而 ckrc1 根的生長(zhǎng)方向隨機(jī)，這說(shuō)明 ckrc1 根向地性很弱。等位突變體ckrc2和ckrc3的表型與ckrc1一致。ckrc1根卷曲生長(zhǎng)和向地性很弱的機(jī)理可能是生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸受到了抑制。生長(zhǎng)

4、素的極性運(yùn)輸需要輸入載體和輸出載體兩類(lèi)蛋白協(xié)同作用。ckrc1 向地性反應(yīng)可被自由透過(guò)細(xì)胞膜的生長(zhǎng)素NAA彌補(bǔ)，說(shuō)明其內(nèi)源IAA很可能在進(jìn)入細(xì)胞這一環(huán)節(jié)上受到抑制。雖然ckrc1根的向地性很弱，但是其花序莖的背地性卻沒(méi)有發(fā)生改變，其原理大概是因?yàn)榛ㄐ蚯o的重力感受位點(diǎn)分布在整個(gè)伸長(zhǎng)區(qū)的內(nèi)皮細(xì)胞，不需要信號(hào)(生長(zhǎng)素)的長(zhǎng)途傳遞。另外，semi-qPCR結(jié)果表明，CKRC基因在根中表達(dá)最高，而在莖中表達(dá)非常弱，說(shuō)明CKRC蛋白在莖中的生理作剛

5、遠(yuǎn)沒(méi)有在根中重要，也許它在莖中的突變不足以引起背地性反應(yīng)減弱。 在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)12天，野生型生長(zhǎng)較快，其根和下胚軸都比ckrc1的長(zhǎng)。然而轉(zhuǎn)移到土壤中培養(yǎng)后，二者在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)狀況沒(méi)有區(qū)別，但是ckrc1開(kāi)花期要遲一周左右。 在MS基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)5天的wt幼苗根尖從OC到根冠最外層有六層細(xì)胞，而ckrc1只有五層，伸長(zhǎng)區(qū)細(xì)胞分裂較慢而分化較快，造成細(xì)胞數(shù)量少，體積大，伸長(zhǎng)區(qū)較短。ckrc1根尖髓部較窄，占根尖比例

6、較小。 半定量RT-PCR證明CKRC在根中表達(dá)量最高，其次是花，再次是葉子，在花序莖和角果中表達(dá)最少，這與genevestigator網(wǎng)站公布的基岡芯片測(cè)定結(jié)果基本一致。 經(jīng)IAA和ZT處理以后，生長(zhǎng)素調(diào)節(jié)基因IAA1和IAA2和細(xì)胞分裂素調(diào)節(jié)基因ARR5和ARR15表達(dá)水平都有明顯的升高，其升高程度在野生型和ckrc1之間沒(méi)有明顯區(qū)別。 本實(shí)驗(yàn)還構(gòu)建了cDNA<,CKRC>-pBI121、全長(zhǎng) CKRC-pC