擬南芥激活標(biāo)簽突變體篩選.pdf

1、目前，我國(guó)乃至世界上有很多地區(qū)的土壤鹽堿化程度較高，并且呈上升趨勢(shì)。在這些地區(qū)，土壤中的高鹽作為非生物脅迫因子嚴(yán)重影響著植物的生長(zhǎng)，同時(shí)極大地限制了該區(qū)域農(nóng)作物的產(chǎn)量和分布，因此，提高植物特別是農(nóng)作物的抗逆能力尤為重要。先前的研究表明，植物的脅迫反應(yīng)是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過(guò)程，且不同植物對(duì)于脅迫的反應(yīng)存在一定差異。鑒于模式植物擬南芥具有基因組小、生長(zhǎng)周期短、自花閉花授粉、易于遺傳轉(zhuǎn)化、便于栽培等特點(diǎn)，同時(shí)，它又是甜土植物，雖然不抗鹽，但是相關(guān)

2、研究表明它的基因組中含有很多與耐鹽相關(guān)的基因，特別適于遺傳學(xué)研究。因此，本實(shí)驗(yàn)以擬南芥激活標(biāo)簽突變體庫(kù)為材料，對(duì)耐鹽及耐低鉀突變體進(jìn)行了篩選，以期獲得擬南芥耐逆機(jī)制的更多信息。
　　本實(shí)驗(yàn)首先運(yùn)用分別含有70 mM NaCl、200 mM NaCl、50μM K+/50 mM NaCl、50μM K+/150 mM NaCl的四種MS培養(yǎng)基對(duì)三個(gè)擬南芥激活標(biāo)簽突變體庫(kù)進(jìn)行了表型篩選，隨后以篩選出的短根突變體 sr為材料，進(jìn)行了突變

3、基因的克隆，結(jié)果如下:
　　1.篩選得到一株低鹽敏感突變體lss。當(dāng)把株系1684與Col0轉(zhuǎn)移至70mM NaCl MS培養(yǎng)基上時(shí)，1684的部分植株(lss)出現(xiàn)了根生長(zhǎng)停止、子葉卷曲萎黃等低鹽敏感現(xiàn)象，敏感植株與普通植株的比例約為1:1，而Col0全部生長(zhǎng)正常。隨后，將鹽敏感植株的T2代幼苗轉(zhuǎn)移至70 mM NaCl的MS培養(yǎng)基上時(shí)，部分植株(T2代lss)也出現(xiàn)了根生長(zhǎng)停止、子葉卷曲萎黃等低鹽敏感現(xiàn)象，敏感植株與普通植株的

4、比例也接近1:1，兩代的分離比都不符合孟德?tīng)柖?，仍需要進(jìn)一步回交驗(yàn)證。
　　2.篩選得到短根突變體sr與mr。篩選中意外發(fā)現(xiàn)株系1082的T1代植株在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)10天左右時(shí)，根長(zhǎng)出現(xiàn)了三種表型的分離:第一種(sr)根明顯短于Ws；第二種(mr)短于Ws，但是長(zhǎng)于sr，介于兩者之間；第三種與Ws相似，三種表型的數(shù)量比接近1:1:1.將 sr、mr、Ws一同移入土壤培養(yǎng)50天左右時(shí)，通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析其他表型如株高、根長(zhǎng)、葉片數(shù)、葉

5、片大小、果莢數(shù)等發(fā)現(xiàn)，sr植株最矮小、根長(zhǎng)最短、葉片和果莢數(shù)最少，Ws植株最高大、根長(zhǎng)最長(zhǎng)、葉片果莢數(shù)最多，突變體mr除基部葉片數(shù)多于Ws外，其余統(tǒng)計(jì)值仍處于兩者之間。隨后，將短根的sr移入土壤單株收取了T2代種子，以相同方式播種于MS培養(yǎng)基培養(yǎng)10天左右，發(fā)現(xiàn)sr的T2代植株全部表現(xiàn)短根，表型沒(méi)有發(fā)生分離。
　　3.以篩選得到的短根突變體sr為材料，進(jìn)行了突變基因的克隆。實(shí)驗(yàn)中首先對(duì)短根突變體 T-DNA的綠色熒光蛋白基因 GF

6、P進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，得到約300-400bp目的條帶，從而驗(yàn)證了兩株突變體的T-DNA都沒(méi)有丟失；通過(guò)TAIL-PCR方法對(duì)短根突變體T-DNA插入位點(diǎn)附近的側(cè)翼序列進(jìn)行了分離，經(jīng)過(guò)三輪擴(kuò)增反應(yīng)后，兩株突變體都出現(xiàn)了目的條帶，長(zhǎng)度約為1500bp；通過(guò)GeneClean法回收純化擴(kuò)增片段后，連接入含有氨芐抗性的pMD18-T載體中，對(duì)大腸桿菌進(jìn)行了轉(zhuǎn)化；通過(guò)氨芐霉素篩選后，提取質(zhì)粒并進(jìn)行了酶切驗(yàn)證，在約1500bp處出現(xiàn)了目的條帶；送測(cè)