擬南芥氧化脅迫敏感突變體的篩選和基因定位.pdf

1、面對(duì)各種環(huán)境壓力如干旱、低溫、鹽堿、重金屬等，植物自身會(huì)有一套調(diào)節(jié)防御的機(jī)制，因此篩選一些抗逆基因，進(jìn)而研究植物防御環(huán)境壓力的機(jī)制具有十分重要的作用和意義。本論文共由四章組成：第一章綜述了本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象擬南芥的生物學(xué)特性和遺傳學(xué)特性，以及所涉及的相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。第二章論述了擬南芥氧化脅迫敏感突變體的篩選和基因定位，共篩選到12株對(duì)H2O2敏感的突變體，并采用TAIL-PCR方法，成功對(duì)突變體H3，H9，H12，H14，H17，H18T-

2、DNA插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列進(jìn)行了擴(kuò)增，同時(shí)利用三引物法，對(duì)T-DNA插入位點(diǎn)進(jìn)行了驗(yàn)證，并在F3代中鑒定出了純合體。第三章論述了擬南芥ICE1突變體的鑒定和植物表達(dá)載體的構(gòu)建以及遺傳轉(zhuǎn)化。在成功的對(duì)ICE1突變體進(jìn)行鑒定的基礎(chǔ)上，克隆得到了ICE1基因及其promotor。此外我們還成功的構(gòu)建了植物表達(dá)載體pEGAD-ICE1，pEGAD-PICE1：ICE1，并利用根癌農(nóng)桿菌成功的將其轉(zhuǎn)化到擬南芥中并獲得了穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株。第四章詳

3、細(xì)論述了擬南芥NAC1和SIP1雙基因反義表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化。
　　 第一章文獻(xiàn)綜述
　　 十字花科植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)是實(shí)驗(yàn)室常用的模式植物。隨著擬南芥(A.thaliana)基因組測(cè)序的完成，公共數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)積累了大量的序列信息，但大部分序列的功能尚不清楚。
　　 利用突變來(lái)研究基因的功能，是認(rèn)識(shí)和了解生命活動(dòng)規(guī)律的常用而有效的方法，突變體是功能基因組學(xué)研究的良好材料。<

4、br>　　 第二章擬南芥氧化脅迫敏感突變體的篩選和基因定位
　　 活性氧(ActiveOxygenSpecies，AOS)是指氧的某些代謝中間產(chǎn)物及其衍生的含氧物質(zhì)，具有較活潑的化學(xué)性質(zhì)?；钚匝醯难芯恳殉蔀槟婢成飳W(xué)研究領(lǐng)域的一個(gè)重大理論課題，而H2O2作為信號(hào)分子在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)節(jié)及其與胞內(nèi)其它信號(hào)分子的時(shí)空關(guān)系還知之甚少。本實(shí)驗(yàn)篩選到12株對(duì)H2O2敏感的突變體(H3，H4，H6，H7，H8，H9，H13，H14，H1

5、7，H18，H61，H71)，并將F2代種子在含500μMH2O2的MS培養(yǎng)基上復(fù)篩，以確定其表型。并通過(guò)TAIL-PCR方法成功將T-DNA插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列擴(kuò)增，測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI比對(duì)，其T-DNA插入基因分別為lipid-associatedfamily，auxinresponsefactor，SIRsulfitereductase，leucine-richrepeatproteinkinase，MLO8calmodulinbin

6、ding，diseaseresistanceprotein，利用三引物法，對(duì)T-DNA插入位點(diǎn)進(jìn)行了驗(yàn)證，并在F3代中鑒定出了純合體。
　　 第三章擬南芥ICE1突變體的鑒定和植物表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化
　　 ICE1作為冷響應(yīng)靶基因的上游調(diào)控因子，低溫下正調(diào)節(jié)低溫誘導(dǎo)的反式作用因子CBF轉(zhuǎn)錄激活因子，使其與COR基因啟動(dòng)子區(qū)域中的CRT/DRE核心元件結(jié)合，提高COR元件的表達(dá)水平，從而使植物的抗寒性大大提高。本實(shí)驗(yàn)

7、采用三引物法對(duì)ICE1T-DNA插入突變體進(jìn)行鑒定得到純合體，以得到的純合體的cDNA為模板擴(kuò)增得到ICE1基因及其promotor。此外我們還成功的構(gòu)建了植物表達(dá)載體pEGAD-ICE1，pEGAD-PICE1：ICE1，并利用根癌農(nóng)桿菌成功的將其轉(zhuǎn)化到擬南芥中獲得了穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株。
　　 第四章擬南芥NAC1和SIP1雙基因反義表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化
　　 本研究通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)篩選得到與SOS2蛋白互作的