腸道病毒71型VP1-VP4在重組腺病毒系統(tǒng)中的表達及免疫學評價.pdf

1、腸道病毒71型（Enterovirus71，EV71）是導致嬰幼兒感染的重要病原之一，可引起多種疾病，具有較廣的疾病譜。其中由EV71引起的兒童手足口?。℉and，F(xiàn)oot，and Mouth Disease，HFMD）最為常見，而且在嬰幼兒容易造成腦干腦炎等神經(jīng)系統(tǒng)感染導致死亡。EV71近年有多地區(qū)流行的趨勢。
　　 EV71在分類上屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，基因組為正鏈單股RNA?；蚪M全長7500bp，編碼區(qū)僅有一個開

2、放閱讀框（ORF），編碼約2200個氨基酸的多聚蛋白（Polyprotein），該多聚蛋白可進一步被水解成P1、P2、P3三個前體蛋白，P1蛋白在3CD蛋白酶的切割作用下生成VP1、VP2、VP3與VP4四種結(jié)構(gòu)蛋白。其中VP1、VP2和VP3裸露于病毒顆粒的表面，VP4位于病毒顆粒衣殼內(nèi)側(cè)與基因組RNA緊密連接，共同構(gòu)成EV71的抗原區(qū)。研究資料表明，雖然該病毒主要抗原決定區(qū)位于VP1，但是VP2、VP3以及VP4上均有抗原抗體結(jié)合功

3、能；已有的實驗結(jié)果顯示單獨的VP1和VP3免疫原性有限，若能獲得VP1～VP4，免疫原性將會得到明顯提高。
　　 鑒于此，我們首先對從流行區(qū)分離的EV71病毒進行了血清學和分子生物學方面的鑒定，采用RT-PCR的方法克隆了P1和3CD基因，借助于載體pcDNA3.0BA構(gòu)建雙順反子穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-P1-3CD和單基因的穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-P1與pShuttle-CMV-3CD。經(jīng)同源重組獲得了重組

4、腺病毒質(zhì)粒rAd-P1-3CD、rAd-P1、rAd-3CD，分別轉(zhuǎn)染293細胞進行包裝，獲得相應的重組腺病毒rAd-P1-3CD、rAd-P1和rAd-3CD，經(jīng)RT-PCR檢測表明，三個重組腺病毒均已轉(zhuǎn)錄目的基因mRNA；免疫熒光和免疫組化檢測結(jié)果表明僅雙順反子重組腺病毒rAd-P1-3CD中可檢測到特異性目的蛋白，而rAd-P1、rAd-3CD中未能檢測到特異性的表達產(chǎn)物，結(jié)果表明重組腺病毒可有效表達EV71 P1和3CD基因，僅

5、含P1或3CD基因的重組腺病毒表達產(chǎn)物未能被特異性抗體所識別，而含P1及3CD蛋白酶基因的雙順反子重組腺病毒表達產(chǎn)物具有EV71特異抗原性，提示P1蛋白只有在3CD蛋白酶的切割作用下才具有抗原性；重組腺病毒通過滴鼻、灌胃和皮下注射的方式分別免疫BALB/C小鼠，ELISA法檢測結(jié)果表明：實驗組小鼠血清中均檢測到抗EV71特異性IgG的抗體，且由rad-P1-3CD免疫后產(chǎn)生的抗體水平明顯高于rAd-P1和rAd-3CD共免疫產(chǎn)生的抗體水

6、平；三種不同的免疫方式結(jié)果證明，灌胃免疫方式最佳，滴鼻次之，皮下注射產(chǎn)生的抗體水平最低。目前有限次數(shù)的中和試驗還未能在實驗組血清中檢測到EV71特異性保護作用，其原因還有待進一步研究。
　　 本實驗成功克隆了包含EV71全部結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)基因P1和具有切割作用的蛋白酶3CD，初步探索了EV71病毒蛋白之間的相互作用，為研究EV71結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白之間的關系打下了基礎；為找尋最合理的相關重組腺病毒疫苗的免疫方式做了初步的探索實驗，