腸道病毒71型(EV71)小鼠模型的建立及在疫苗評價中的應用.pdf

1、腸道病毒71型（Enterovirus71，EV71）引起的腸道病毒EV71感染疾病多發(fā)生于嬰幼兒，通常引起患者手足口病和皰疹性咽峽炎，嚴重時引起無菌性腦膜炎、腦干腦炎和脊髓灰質炎樣的麻痹等疾病，致殘及病死率較高。
　　 自1969年發(fā)現(xiàn)以來，EV71病毒已在世界范圍內(nèi)引起十多次爆發(fā)與流行，EV71病毒在中國大陸的流行自80年代首次報道以來，已經(jīng)存在了20多年。2009年春季我國報告40，000例EV71引發(fā)的手足口病例，其中重

2、癥病例80例。今年同期，手足口病疫情在我國又有卷土重來的趨勢，截止5月4日，全國報告手足口病例427，278例，死亡260例，其中，重癥及死亡患者以感染EV71者居多，且多為5歲以下學齡前兒童。
　　 很多研究報道已經(jīng)證實了研制一種腸道病毒疫苗的可行性，但由于缺乏適合有效的動物模型用于評價疫苗，目前，我們?nèi)詻]有特效的藥物或是疫苗來防治EV71的感染，所以及時了解動物感染情況和建立模型，顯得非常迫切和重要。近年來，科學家通過在乳鼠

3、和短尾猴等動物體內(nèi)進行的EV71感染實驗對病毒的致病機制、感染途徑、體內(nèi)散布等方面進行了研究，發(fā)現(xiàn)不是所有的EV71臨床分離株都能感染動物，也不是同一個EV71毒株感染不同動物出現(xiàn)的癥狀都相同，這可能是由于EV71病毒基因型和亞型的不同。所以，在本實驗中我們針對目前我國EV71方面研究的匱乏與防治藥物和疫苗研制的需要，運用阜陽地區(qū)手足口病患者臨床分離EV71株進行實驗，以期建立一個適用的EV71動物感染模型，用于EV71疫苗的研制和評價

4、工作。
　　 EV71病毒對動物的感染不但有物種依賴性，還有年齡依賴性。在預實驗中，我們通過對不同年齡段的ICR小鼠、SCID小鼠、豚鼠、中國恒河猴等用不同的途徑大劑量感染病毒后發(fā)現(xiàn)，1日齡ICR小鼠是對本實驗室毒株最敏感的實驗動物，腹腔注射途徑是最佳的感染途徑。挑選到合適的實驗動物后，為了得到感染力更強的毒株，我們借鑒臺灣科學家復強毒株的方法，在小鼠肌肉組織連續(xù)傳代制備了EV71小鼠適應株，通過對兩毒株的比較研究發(fā)現(xiàn)：傳代株較

5、原代株有較強的肌肉組織嗜性和RD細胞毒性；感染1日齡小鼠后在各組織中的分布更廣；在肌肉組織中的病毒量有所提高；兩毒株VP1區(qū)氨基酸系列有一定差異，可能與病毒毒力存在一定關系。利用所建立病毒檢測和模型評價體系我們對感染小鼠進行了臨床表現(xiàn)、病原學、病毒分子生物學和病理學等方面的研究，繪制出傳代株感染小鼠后7天內(nèi)病毒的復制曲線；發(fā)現(xiàn)感染后小鼠小腸、骨骼肌、心肌各組織出現(xiàn)特定病理變化；免疫組化在骨骼肌中發(fā)現(xiàn)病毒定位，從而建立起EV71小鼠感染模

6、型，并成功運用于本研究所EV71亞單位疫苗的研制工作中。
　　 本實驗中針對EV71病毒建立的半定量RT-PCR，Real time RT-PCR，IEA，IFA，病毒分離，免疫組織化學等方法為EV71病毒的感染特點和致病機制等方面的研究提供了良好的技術基礎，所建立的EV71感染ICR小鼠動物模型，為病毒疫苗和抗病毒藥物的研究提供了確實可用的動物評價工具。同時通過對EV71毒株的體內(nèi)、體外特性，包括細胞學和免疫學等方面特性的研究