兩種蘭花病毒的生物學(xué)特性及其抗血清的制備與應(yīng)用.pdf

1、建蘭花葉病毒(Cymbidium mosaic virus，CyMV)和齒蘭環(huán)斑病毒(Odontoglossumringspor virus,ORSV)是蘭花上最為重要的兩種病毒，侵染蘭花后可使蘭花葉片、花型、花色受到不同程度的影響，造成蘭花品質(zhì)明顯下降，商品價(jià)值大幅度降低。本研究利用傳統(tǒng)方法和現(xiàn)代基因工程技術(shù)分別制備了這兩種病毒的抗血清，對(duì)于加強(qiáng)蘭花病毒的檢測(cè)和控制，防止病毒病的發(fā)生和傳播擴(kuò)散具有重要意義。 從漳州地區(qū)采集獲得

2、具有典型病毒病癥狀的蘭花樣本，經(jīng)ID-ELISA檢測(cè)、電鏡觀察和生物學(xué)測(cè)定三種方法的診斷鑒定，證明樣品不同程度地感染了CyMV和ORSV。使用卡特蘭和建蘭病葉分別提純到6.4 mg的CyMV和26.8 mg的ORSV，并用于免疫家兔獲得較為特異的抗血清，效價(jià)分別達(dá)到1:512000和1：256000。 使用RT-PCR技術(shù)成功擴(kuò)增到CyMV和ORSV福建漳州分離物外殼蛋白基因，并克隆到pMD18-T載體上，雙酶切重組質(zhì)粒后，分別

3、將目的片段插入表達(dá)載體pET-29a(+)，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，篩選獲得陽(yáng)性重組表達(dá)質(zhì)粒29a-CyMVCP和29a-ORSVCP，并測(cè)定插入的序列，分析是否成功克隆目的基因，且確保在載體中沒(méi)有發(fā)生移碼突變。序列分析表明，插入的CyMV福建漳州分離物外殼蛋白基因的ORF長(zhǎng)672 bp，編碼223 aa，蛋白分子質(zhì)量約為23.6 KDa，核苷酸序列同已報(bào)道的新加坡分離物(AF405719.1)的同源性最高，為98.7％，而氨基酸序

4、列同源性達(dá)97.8％；ORSV福建漳州分離物外殼蛋白基因的ORF長(zhǎng)477 bp，編碼158 aa，蛋白分子質(zhì)量約為18.0 KDa，核苷酸序列同已報(bào)道的中國(guó)廣東分離物(AY360407)同源性最高，送到99.8％，僅一個(gè)堿基的差異，而氨基酸序列同源性達(dá)100％。 重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，加IPTG誘導(dǎo)獲得與預(yù)期大小一致的融合蛋白條帶。CyMV CP融合蛋白和ORSV CP融合蛋白分別使用鎳瓊脂糖凝膠柱F

5、F純化和12％SDS-PAGE分離割膠回收，產(chǎn)物用于免疫家兔制備特異性抗血清。Western blot鑒定結(jié)果表明所制備的抗血清與誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白起特異性反應(yīng)。由兩種融合蛋白制備的抗血清效價(jià)均達(dá)到1：51200，工作濃度分別定為1：1000和1：1600，檢測(cè)病汁液的靈敏度分別達(dá)到0.39 mg/mL和0.1 mg/mL，同TMV(Tobacco mosaic virus)等11種病毒均無(wú)明顯的血清學(xué)交叉反應(yīng)，其中CyMV CP融合蛋