庚型肝炎病毒生物學(xué)特性及其與丙型肝炎病毒的比較研究.pdf

1、該文亦在HGV體內(nèi)外復(fù)制與表達(dá)、HGV致病性、HGV與HCV復(fù)制和表達(dá)差異及疫苗評(píng)價(jià)等方面進(jìn)行了系列探討.一、全長(zhǎng)HGV轉(zhuǎn)基因小鼠的遺傳育種與特性研究:轉(zhuǎn)基因小鼠是病毒的有效體系,利用該室克隆出的完整HGV cDNA克隆(HGV)構(gòu)建由CMV啟動(dòng)子調(diào)控的含HGV全長(zhǎng)基因的目的片段,用顯微注射法建立了整合有HGV全長(zhǎng)基因的Founder小鼠.該研究利用已建立的4株(<'＃>2、<'＃>4、<'＃>8、<'＃>9)Founder小鼠

2、分別和同系正常異性小鼠交配的方式進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因小鼠傳代培育及建系.所產(chǎn)仔鼠經(jīng)PCR和Southern blot進(jìn)行篩選并以ELISA檢測(cè)小鼠血清HGV抗原含量,免疫組織化學(xué)法檢測(cè)小鼠組織HGV抗原表達(dá).表達(dá)量較高的陽性小鼠被用于進(jìn)一步傳代、保種.目前,<'＃>2號(hào)Founder小鼠已傳至F<,5>代并從中篩選出了表達(dá)量相對(duì)較高的小鼠品系,<'＃>8號(hào)Founder小鼠已傳至F<,3>代,但<'＃>4、<'＃>9號(hào)Founder小鼠在傳代過

3、程中整合的外源基因丟失.對(duì)<'＃>2號(hào)Founder小鼠F<,1>-F<,5>代HGV NS3基因的分析表明,至少在有效的測(cè)序范圍內(nèi),未發(fā)現(xiàn)核苷酸的突變或缺失.轉(zhuǎn)基因小鼠各組織RT-PCR檢測(cè)表明:HGV RNA可以在多個(gè)組織檢測(cè)到,而且肝、腎、肺等若干組織還有復(fù)制中間體負(fù)鏈RNA的存在.二、鼠傷寒沙門氏菌pagC啟動(dòng)子的克隆與活性分析 從鼠傷寒沙門菌中克隆出pagC啟動(dòng)子(PpagC),構(gòu)建體內(nèi)激活的表達(dá)質(zhì)粒pZW,插入庚型肝炎病毒(

4、HGV)NS3基因,構(gòu)建出表達(dá)質(zhì)粒pZWNS3.以其轉(zhuǎn)化減毒鼠傷寒沙門菌SL7207,觀察PpagC的啟動(dòng)活性.三、含體內(nèi)激活啟動(dòng)子的重組減毒鼠傷寒沙門菌能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因鼠細(xì)胞免疫應(yīng)答 該研究以庚型肝炎病毒(hepatitis G virus,HGV)轉(zhuǎn)基因小鼠為模型,探討逆轉(zhuǎn)免疫耐受的方法及與HGV致病性的關(guān)系.四、HCV 1a/1b型嵌合體能在HepG2細(xì)胞內(nèi)復(fù)制與表達(dá) 為研究丙型肝炎病毒(hepatitis G virus,HGV)1

5、a和1b型嵌合體全長(zhǎng)cDNA在HepG2細(xì)胞中的復(fù)制和表達(dá).以HCV 1a/1b嵌合體cDNA構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,免疫組化和Western blotting檢測(cè)HCV蛋白表達(dá),RT-PCR檢測(cè)HCV正、負(fù)鏈RNA.結(jié)果,轉(zhuǎn)染細(xì)胞中檢測(cè)到分子量約70KD的HCV NS3蛋白,轉(zhuǎn)染細(xì)胞連續(xù)傳20代,仍能檢測(cè)到HCV正、負(fù)鏈RNA.證明該HCV嵌合體可以在細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá),HCV 1b型的RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)可以起

6、始含1a型非編碼區(qū)的病毒復(fù)制.五、庚型肝炎病毒和丙型肝炎病毒的比較研究:全長(zhǎng)cDNA克隆在體內(nèi)外的表達(dá)與復(fù)制.HGV和HCV同屬黃病毒科.二者有相似的基因結(jié)構(gòu).然而,HGV和HCV在致病性、嗜性、流行病學(xué)等方面確存在很大差異.研究HGV和HCV的復(fù)制和表達(dá)有助于理解二者生物學(xué)差異的機(jī)制.該課題的特色與創(chuàng)新之處:1、進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因小鼠的遺傳育種工作并篩選出能穩(wěn)定傳代和較高表達(dá)的HGV轉(zhuǎn)基因小鼠品系,為在分子水平、細(xì)胞水平及整體水平研究HGV

7、提供了一個(gè)很好的技術(shù)平臺(tái).2、將體內(nèi)激活的pagC啟動(dòng)子(PpagC)應(yīng)用于重組減毒傷寒沙門菌口服疫苗的構(gòu)建.3、以HGV轉(zhuǎn)基因小鼠為慢性帶病毒的動(dòng)物模型,探討了逆轉(zhuǎn)免疫耐受的方法.證明以體內(nèi)激活的PpagC為轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的重組減毒傷寒沙門菌具潛在的免疫治療作用,為慢性病毒性肝炎的治療提供了一個(gè)新的思路.同時(shí),打破T細(xì)胞耐受的轉(zhuǎn)基因小鼠使HGV的研究更接近于自然感染.4、證明HCV嵌合體可以在細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá),HCV 1b型的RNA依賴