腸道病毒71型抗血清的制備及初步應(yīng)用研究.pdf

1、腸道病毒71型(EV71)屬于微小核糖核酸病毒科(Picornavirdae),腸道病毒屬(Enterovirus,EV)。EV71的感染可以導(dǎo)致手足口病(HFMD),一般癥狀輕微,僅表現(xiàn)為皮疹或皰疹性咽峽炎,預(yù)后良好。重癥病例病情進(jìn)展迅速,可表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累和急性呼吸循環(huán)衰竭。人是EV71的唯一自然宿主,對(duì)EV71普遍易感,但以嬰幼兒和5歲以下兒童感染為主。
　　 目前國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室診斷EV71感染的方法主要有病毒分離、酶

2、聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、中和試驗(yàn)、免疫組化檢測(cè)、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、核苷酸序列測(cè)定、基因芯片技術(shù)等,每種方法各有優(yōu)缺點(diǎn),而目前基層實(shí)驗(yàn)室尚缺乏快速和準(zhǔn)確的診斷方法。
　　 本次研究以不同免疫方案制備EV71抗血清,篩選最佳免疫方案,同時(shí)利用制備的EV71高價(jià)抗血清建立間接ELISA試驗(yàn)方法,檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)室采集的咽拭子標(biāo)本,對(duì)基層實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展EV71早期診斷具有重要意義。
　　 目的:
　　

3、1.比較不同免疫方案制備EV71抗血清的免疫效果,選擇最優(yōu)免疫方案,為下一步制備EV71單克隆抗體(McAb)奠定免疫基礎(chǔ)。
　　 2.用制備的EV71抗血清建立間接ELISA試驗(yàn)法,檢測(cè)HFMD患兒咽拭子標(biāo)本中的EV71,評(píng)價(jià)其檢出效果。
　　 方法:
　　 1.用EV71的SDLY107株感染RD細(xì)胞并收獲病毒,初步純化后用50％終點(diǎn)法測(cè)定病毒滴度,取一部分病毒液以紫外線燈(40w)照射對(duì)病毒進(jìn)行滅活。

4、>　　 2.將BALB/c鼠隨機(jī)分為5組,每組9只。其中1～4組為實(shí)驗(yàn)組,第5組為對(duì)照組。1、2組以滅活病毒免疫,3、4組以活病毒免疫,1、3組的免疫間隔時(shí)間為2周,2、4組為3周;第5組用磷酸鹽緩沖液(PBS)免疫,免疫間隔2周,每組各免疫4次。
　　 3.末次免疫后摘眼球取血,用間接ELISA試驗(yàn)法和中和試驗(yàn)(固定病毒-稀釋抗血清)法分別檢測(cè)各組小鼠血清抗體滴度。
　　 4.用RD細(xì)胞分離2010年山東省臨沂市HF

5、MD暴發(fā)期問(wèn)采集的44份患兒咽拭子標(biāo)本中的病毒,RT-PCR法擴(kuò)增病毒分離液中的EV71并測(cè)序鑒定,作為EV71檢出的“金標(biāo)準(zhǔn)”。
　　 5.以咽拭子標(biāo)本液作為包被抗原,制備的EV71抗血清作為一抗,辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG作為二抗,建立間接ELISA試驗(yàn)法檢測(cè)標(biāo)本中的EV71,與RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果:
　　 1.50％終點(diǎn)法測(cè)得EV71的病毒滴度為2×10-3.25

6、/0.1ml,紫外線照射法完全滅活EV71的最短時(shí)間為30min。
　　 2.ELISA結(jié)果顯示,4個(gè)實(shí)驗(yàn)組均產(chǎn)生陽(yáng)性抗體(A/A0≥2.1),對(duì)照組抗體陰性(A/A0＜2.1),1～5組吸光度(A)值依次為1.0817±0.2897、1.0296±0.3719、1.0748±0.3749、1.4929±0.2159、0.1687±0.0218。對(duì)其進(jìn)行單因素方差分析,F=23.449,P＜0.05,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,LSD-t

7、檢驗(yàn)結(jié)果,第4組與1、2、3組差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),而其余組差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 3.第4組(活病毒間隔3周免疫組)ELISA法測(cè)得抗體滴度為1.024×105,中和試驗(yàn)法測(cè)得抗血清中和效價(jià)為1∶64。
　　 4.咽拭子標(biāo)本接種RD細(xì)胞并盲傳二代后,100％出現(xiàn)細(xì)胞病變,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增并測(cè)序鑒定,均為EV71。
　　 5.以EV71抗血清作為一抗,ELISA法檢測(cè)咽拭子標(biāo)本,

8、陽(yáng)性率為100％,與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果相比,靈敏度、特異度、符合率均為100％。
　　 結(jié)論:
　　 1.不同免疫方案制備的EV71抗血清,抗體滴度不完全相同,其中活病毒間隔3周免疫組抗體滴度最高,可作為制得高滴度EV71抗血清的理想選擇,并為制備EV71McAb奠定免疫基礎(chǔ)。
　　 2.以EV71建立的間接ELISA法可早期、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)患兒咽拭子標(biāo)本中的EV71,與RT-PCR擴(kuò)增病毒分離液的結(jié)果相比,靈