鄰苯二甲酸二丁酯和苯并[a]芘對大鼠睪丸支持細胞的聯(lián)合毒性研究.pdf

1、隨著人類社會的發(fā)展和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)規(guī)模的擴大，人類排放到水環(huán)境中的污染物越來越多。在眾多的污染物中，有機污染物占的比例最大，而有機物中的持久性有機污染物是一類環(huán)境滯留時間長、難降解、易通過食物鏈富集、危害大的化學物質。除了對其致癌致畸致突變等作用的研究外，如何評價水中有機物混合污染對人體的危害是研究者們目前面臨的難題。對水中有機物的檢測發(fā)現(xiàn)，鄰苯二甲酸酯類和多環(huán)芳烴類是污染最為廣泛的兩類化合物，其中鄰苯二甲酸酯類的鄰苯二甲酸二丁酯(dibu

2、tylphthalate，DBP)污染最為嚴重，而多環(huán)芳烴類的苯并[a]芘[benzo(a)pyrene，BaP]為該類化合物中毒性最強。本研究選用DBP和BaP作為有機污染物的代表，觀察其單獨和聯(lián)合作用于體外培養(yǎng)的大鼠睪丸支持細胞后的毒性效應，以期為建立評價有機物混合污染對人體健康危害的體外檢測方法提供實驗依據(jù)。 一、體外培養(yǎng)大鼠睪丸支持細胞模型的建立 選用出生后18-21天的雄性SD大鼠，采用直接二步酶消化法與低滲處

3、理純化法相結合，并使用低速離心與二次貼壁的方法，制備睪丸大鼠支持細胞。在細胞分離后的48h，用20mmol/L Tris-HCl處理生精細胞，并于細胞融合80％后消化傳代，用油紅0、堿性磷酸酶染色，并通過透射電鏡和HE染色觀察以及支持細胞特異性表達抗原FasL免疫組化鑒別分離的支持細胞純度。染色后鏡下可見細胞邊緣不清，胞體呈寬大的柱狀或不規(guī)則狀，有粗大的突起，細胞質內可見小吞噬物或小空泡，核大呈藍色，卵圓形或不規(guī)則形，核質均勻，多于95

4、％的細胞胞質中有大小不等的紅色脂滴，此為支持細胞的特異性標志之一，生精細胞與間質細胞均不著紅色。被堿性磷酸酶染色的生精細胞和管周肌樣細胞少于1％，透射電鏡可觀察到支持細胞的特異性結構-衛(wèi)星小體，而分離培養(yǎng)的絕大部分細胞都能表達特異性標志其功能活性的FasL。通過對其生長曲線的檢測，確定分離后5-9天為其對數(shù)生長期，適合采用此期的支持細胞進行毒理學實驗。至此，成功建立體外培養(yǎng)大鼠睪丸支持細胞模型。 二、DBP和BaP分別及聯(lián)合染毒

5、對大鼠睪丸支持細胞的毒作用 1.共設立15個試驗組和2個對照組在2個染毒時間點開展MTT實驗及細胞計數(shù)，即以DMSO為溶劑的0.1、1、10、100、500μg/mlDBP各組和0.01、0.1、1、10、50μg/mlBaP各組以及DBP+BaP聯(lián)合染毒(按劑量從低到高依次對應聯(lián)合)、DMSO組和空白對照組。實驗結果顯示，DBP在一定的劑量下(500μg/ml，12h)可以刺激支持細胞增殖，隨著染毒時間的增加高劑量刺激增殖作用

6、消失，而較低劑量(100μg/ml，24h)出現(xiàn)刺激增殖的作用。BaP在24h內不影響支持細胞的生長，二者聯(lián)合染毒呈現(xiàn)出與DBP的刺激增殖相似的作用，但高劑量聯(lián)合染毒反而抑制細胞的增殖。細胞計數(shù)結果與此一致。據(jù)此選擇1、10、100μg/mlDBP各組和0.1、1、10μg/mlBaP各組以及DBP+BaP聯(lián)合染毒(按劑量從低到高依次對應聯(lián)合)開展所有后續(xù)實驗。 2.培養(yǎng)液中乳酸含量的高低可以反映支持細胞的功能。用選定劑量染毒支

7、持細胞后在12、24、48h三個時間點檢測培養(yǎng)液中的乳酸。DBP在高劑量下(100μg/ml)可以刺激支持細胞乳酸的分泌，而BaP在短時間內(12h)抑制乳酸的分泌，而隨著時間的延長(48h)可顯著刺激乳酸分泌。二者聯(lián)合染毒在12h和24h內只有高劑量組(100μg/mlDBP+10μg/ml BaP)刺激乳酸分泌，染毒延長至48h后各組均能刺激乳酸分泌。 3.波形蛋白是細胞骨架中一種重要中間纖維，在細胞形態(tài)維持、細胞運動、細胞

8、信號轉導和細胞凋亡等方面起著重要作用。支持細胞染毒12h后，各染毒組均不引起波形蛋白的表達變化；24h后，10μg/mlDBP與1μg/mIBaP可誘導波形蛋白表達下降(p<0.05)，100μg/mlDBP組和10μg/mlBaP組的波形蛋白下降更為顯著(p<0.01)，高劑量聯(lián)合染毒組(100μg/ml DBP+10μg/ml BaP)波形蛋白的表達出現(xiàn)顯著降低。染毒48h后，DBP和BaP單獨染毒中、高劑量組與DMSO組相差顯著(

9、分別為P<0.05和P<0.01)，聯(lián)合染毒各組的波形蛋白表達均顯著減少，該結果提示DBP與BaP單獨染毒均可降低支持細胞波形蛋白的表達，而且呈劑量依賴關系，二者聯(lián)合呈現(xiàn)輕度相加作用。高劑量組染毒后細胞波形蛋白形狀發(fā)生變化，從多變形收縮成索狀或圓形，細胞間的空隙明顯增大。 4.微管蛋白是一種具有多種功能的細胞骨架蛋白，對微管蛋白的損傷將影響生精上皮的結構和支持細胞對生精細胞的支持作用。各染毒組12h后細胞內的α-tubulin蛋

10、白的表達未見改變；染毒24h后，BaP高劑量組α-tubulin蛋白表達明顯增加(P<0.05)；48h后，DBP高劑量組的α-tubulin蛋白表達顯著上升(P<0.05)，BaP低劑量組和中劑量組與DMSO組相比α-tubulin表達增加(P<0.05)，高劑量組增加的幅度更大(P<0.01)。令人感興趣的是聯(lián)合染毒各組并沒有出現(xiàn)顯著變化，說明二者的聯(lián)合作用對支持細胞α-tubulin的影響要小于二者單獨染毒。該結果提示DBP和Ba

11、P均可以干擾支持細胞的微管蛋白，BaP的強度大于DBP，但是二者聯(lián)合染毒后該干擾作用消失，呈現(xiàn)拮抗效應。 5.支持細胞分泌的抑制素(inhibin，INH)和轉鐵蛋白(transffen，Tf)在生精過程的調節(jié)中具有重要作用。DBP染毒12h以后并不影響INH B和Tf mRNA表達；24h后，三個劑量組均刺激INH B的表達，而僅高劑量組刺激Tf表達。但48h后，均顯著抑制INH B和Tf mRNA的表達，具有劑量依賴關系。B

12、aP染毒12h后，中、高劑量組INH B的表達均顯著下降，呈劑量依賴關系，而對Tf的表達無影響；24h后，高劑量組延續(xù)對INH B的抑制，而三個組均可刺激Tf的表達；染毒時間延長至48h后，BaP三個組對INH B和Tf均有顯著抑制作用。DBP和BaP聯(lián)合后二者對INH B的影響表現(xiàn)為拮抗效應，而對Tf的作用與單獨作用相一致。 三、DBP和BaP分別及聯(lián)合染毒對大鼠睪丸支持細胞MAPK途徑的影響 采用功能基因芯片檢測10

13、μg/ml DBP、1μg/ml BaP和二者聯(lián)合染毒組MAPK途徑相關基因的變化，并用Western blot檢測全部9個染毒組及DMSO組的ERK、JNK和P38及各自磷酸化水平的變化。結果如下： 1.10μg/ml DBP染毒后Egr1、c-fos、Ksr1、HPK1、Jnk3、ERKI、NFAT3、RPLP1這8個基因與對照組比顯著下調，而p388顯著上調。該結果提示，DBP染毒后對MAPK的三條通路：ERK1/2、JN

14、K/SAPK、P38MAPK均有影響，除此之外還可改變早期的反應基因以及HPK1、Ksr1等MAPK通路上游分子的表達。用western blot檢測蛋白表達顯示，DBP染毒后各組總ERK的變化不顯著，該結果與erk基因顯著下調不一致，p-ERK的表達各實驗組增加，呈劑量反應關系；各組JNK/SAPK總蛋白和磷酸化的JNK1/2的表達明顯下降，且呈劑量反應關系；從10μg/mIDBP開始誘導P38表達增加，呈劑量反應關系，但各組磷酸化水

15、平并沒有顯著差異。 2.1μg/ml BaP染毒后，MAPK通路僅有Jnk3一個基因顯著下調。蛋白檢測發(fā)現(xiàn)，總ERK未見顯著變化，而p-ERK的表達各組均有增加；JNK/SAPK總蛋白的表達各組略有降低，而p-JNK各組均下降，呈劑量反應關系；BaP各組對支持細胞P38的表達無影響。 3.DBP+BaP聯(lián)合染毒后，與DMSO組相比僅4個基因發(fā)生變化：Cyclin D2和p386顯著上調，而Egr1和c-fos顯著下調，該

16、結果表明聯(lián)合染毒對MAPK途徑的影響要小于DBP單獨染毒。而聯(lián)合染毒組和DBP組相比，Cyclin D2、Ksrl、ERK1、NFAT3、RPLP1和Mknkl共7個基因上調，該結果提示，加入BaP后，DBP單獨染毒使支持細胞發(fā)生的基因表達變化得到修正，這上調的7個基因在DBP單獨染毒時均下調，二者聯(lián)合呈現(xiàn)拮抗效應，這與第二部分實驗中多項指標顯示DBP與BaP聯(lián)合染毒后出現(xiàn)拮抗效應相一致。蛋白結果顯示，聯(lián)合染毒各組總ERK未見顯著變化，

17、而p-ERK的表達較DBP染毒組高；聯(lián)合染毒的高劑量組JNK/SAPK總蛋白的表達與對照比下降，而p-JNK表達量反而高于各單獨染毒組；總P38的變化趨勢與DBP各組相似，隨著染毒劑量的升高而表達增加，但各組磷酸化水平并沒有顯著差異。 總之，一定劑量的DBP可以刺激睪丸支持細胞的增殖，DBP和BaP均可以刺激乳酸的分泌(BaP為先抑制后刺激)，二者均可降低波形蛋白和增加微管蛋白α的表達，對INH B和Tf的作用表現(xiàn)為先刺激后抑制