人毛乳頭細胞生長相關(guān)蛋白生物學(xué)活性的初步研究.pdf

1、在組織器官(如牙齒、腸、羽毛等)的發(fā)育和再生過程中,上皮細胞和間質(zhì)細胞的相互作用具有極為重要的意義.研究表明,位于毛囊底部的特殊間質(zhì)成分——毛乳頭在毛囊的形態(tài)學(xué)發(fā)生和毛囊的周期性生長調(diào)控中起主導(dǎo)作用.毛乳頭細胞作為毛囊的主要間質(zhì)成分,在毛囊研究中具有相當(dāng)重要的地位.在胚胎發(fā)育過程中,毛乳頭細胞來源于位于表皮基板下方的一群凝集性生長的真皮間質(zhì)細胞.在鼠觸須、鼠體被毛、羊和人皮膚等分離培養(yǎng)毛乳頭細胞,培養(yǎng)的毛乳頭細胞在形態(tài)上類似于真皮成纖維

2、細胞,但一般均表現(xiàn)為凝集性生長方式,在培養(yǎng)皿中形成相互重疊的細胞團,而周圍則形成空隙;真皮成纖維細胞則表現(xiàn)為平鋪式的融合性生長.在培養(yǎng)情況下,毛乳頭細胞的凝集性生長特性將隨著細胞傳代次數(shù)的增多而逐步喪失,一般情況下,第6代以后細胞不再表現(xiàn)凝集性生長.凝集性生長是毛乳頭細胞的重要生物學(xué)特性之一,凝集性生長與毛乳頭細胞的功能和分化狀態(tài)有關(guān).但是毛乳頭細胞凝集性生長的分子機制不明,同時凝集性生長狀態(tài)下毛乳頭細胞所分泌的蛋白在毛囊發(fā)育和毛囊周期

3、性生長調(diào)控中的作用也少有研究.毛乳頭是一個可誘導(dǎo)毛囊生長的結(jié)構(gòu),它能發(fā)送或接受信號,從而影響毛囊的發(fā)育和周期性生長.最近研究發(fā)現(xiàn)了許多在毛囊形態(tài)學(xué)發(fā)生和周期性生長中起作用的信號分子,如成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factors, FGFs)、骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)、神經(jīng)營養(yǎng)因子、血小板衍生生長因子(platelet derived growth fac

4、tor , PDGF)等.這些信號分子大多來源于毛囊上皮細胞,它們構(gòu)成了一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò),尚不能確定其中具有關(guān)鍵作用的因子.研究這些因子可能難以從根本上闡明毛囊發(fā)育和周期性生長的具體機制,但是我們對于毛乳頭細胞自身分泌的生長相關(guān)蛋白在其凝集性生長和毛囊周期性生長調(diào)控中的作用知之甚少,因此有人提出,毛乳頭細胞自身分泌的生長相關(guān)蛋白將是今后毛囊研究的重要內(nèi)容.鑒于以上認識,我們認為研究毛乳頭細胞凝集性生長狀態(tài)下所分泌的特異性蛋白有助于闡明毛乳

5、頭細胞凝集性生長、毛囊發(fā)育及周期性生長調(diào)控的分子機制.因此,通過收集凝集性生長人毛乳頭細胞培養(yǎng)液上清制備成條件培養(yǎng)基,分別作用于傳代培養(yǎng)后失去凝集性生長特性的毛乳頭細胞和臨床斑禿患者,用來闡明毛乳頭細胞生長相關(guān)蛋白對活力較弱毛乳頭細胞的影響和對毛囊生長周期的調(diào)節(jié)作用,以期為臨床治療禿發(fā)性疾病探索一種新的治療途徑.在該研究中,我們首先從人頭皮毛囊分離培養(yǎng)人毛乳頭細胞,這些細胞具有周期性凝集性生長特性,而且這種特性隨著傳代次數(shù)的增多而逐步喪

6、失.凝集性生長作為毛乳頭細胞的固有特性與其生物學(xué)功能密切相關(guān).我們收集凝集性生長人毛乳頭細胞培養(yǎng)液上清制備成條件培養(yǎng)基,培養(yǎng)9代毛乳頭細胞,發(fā)現(xiàn)其能將非凝集性生長的毛乳頭細胞轉(zhuǎn)化為凝集性生長狀態(tài);我們又將條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的9代毛乳頭細胞與基礎(chǔ)養(yǎng)基培養(yǎng)的9代毛乳頭細胞分別作細胞計數(shù),發(fā)現(xiàn)條件培養(yǎng)基有明顯促進高傳代毛乳頭細胞增殖的能力;我們再將2代毛乳頭細胞與9代毛乳頭細胞共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)9代毛乳頭細胞有向低傳代毛乳頭細胞轉(zhuǎn)化的趨勢,而2代毛乳頭

7、細胞未出現(xiàn)向高傳代轉(zhuǎn)化的趨勢.這些結(jié)果表明凝集性生長毛乳頭細胞所分泌的生長相關(guān)蛋白與毛乳頭細胞的凝集性生長等生物學(xué)特性有關(guān).我們應(yīng)用3H-TdR摻入技術(shù),發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)的毛乳頭細胞,其3H-TdR摻入值隨著細胞傳代增高而降低,而對應(yīng)的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的高傳代毛乳頭細胞其3H-TdR摻入值是相對較高的,這表明條件培養(yǎng)基可促進活力較弱的高傳代毛乳頭細胞的增殖;我們應(yīng)用RT-PCR技術(shù),觀察分泌性蛋白血管內(nèi)皮生長因子mRNA的表達狀況,發(fā)現(xiàn)

8、基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)的毛乳頭細胞,其血管內(nèi)皮生長因子mRNA的表達隨著細胞傳代增多而降低,而對應(yīng)的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的高代毛乳頭細胞其血管內(nèi)皮生長因子的表達是相對較高的,這表明條件培養(yǎng)基可促進活力較弱的毛乳頭細胞的分泌性蛋白的基因表達;我們再在電鏡下觀察條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的高代毛乳頭細胞,發(fā)現(xiàn)其細胞核靠邊,細胞內(nèi)核糖體較多,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌成池,呈圓形和橢圓形,而用基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)的高傳代毛乳頭細胞,其電鏡下可見其細胞核居中,細胞內(nèi)核糖體較少,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌成星

9、形或條索狀,這表明條件培養(yǎng)基可促進活力較弱的高傳代毛乳頭細胞的分泌.這些結(jié)果表明凝集性生長毛乳頭細胞所分泌的生長相關(guān)蛋白可促進活力較弱高傳代毛乳頭細胞的增殖和分泌性蛋白的表達和分泌.我們收集凝集性生長人毛乳頭細胞培養(yǎng)液上清制備成毛乳頭細胞條件培養(yǎng)液凍干粉,經(jīng)熱源試驗、急性毒性試驗、細菌培養(yǎng)、真菌培養(yǎng)等檢查無異常,經(jīng)查排除人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒螺旋體感染,經(jīng)該院倫理委員會討論同意臨床使用,并征得患者同意且簽署知情

10、同意書的情況下應(yīng)用于斑禿患者.我們發(fā)現(xiàn)在50例毛乳頭細胞條件培養(yǎng)液治療的斑禿患者中,除2例無效外其余均有一定療效,這與去炎松治療組比較取得了良好的療效.毛乳頭細胞條件培養(yǎng)液組、去炎松組和空白組治愈率分別為74﹪、50﹪、10﹪,有效率分別為96﹪、73﹪、30﹪,毛乳頭細胞條件培養(yǎng)液組其治愈率和總有效率均高于去炎松組和空白組(P<0.05).6月后隨訪,毛乳頭細胞條件培養(yǎng)液組、去炎松組和空白組治愈率分別為82﹪、58﹪、20﹪,毛乳頭細

11、胞條件培養(yǎng)液組其治愈率高于去炎松組和空白組(P<0.05).通過以上研究,我們成功地收集了凝集性生長人毛乳頭細胞的培養(yǎng)上清,制備成條件培養(yǎng)基,將其培養(yǎng)高傳代人毛乳頭細胞,發(fā)現(xiàn)能使高傳代人毛乳頭細胞向低傳代轉(zhuǎn)化,能使高傳代細胞出現(xiàn)凝集性生長、3H-TdR摻入值增高、血管內(nèi)皮生長因子mRNA的表達水平增高、電鏡下顯示細胞超微結(jié)構(gòu)其分泌活力增加;再將條件培養(yǎng)基作用于斑禿患者,發(fā)現(xiàn)有明顯的促進斑禿區(qū)頭發(fā)生長的作用.這些成果為進一步深入研究毛乳頭