人牙周膜細(xì)胞與牙齦成纖維細(xì)胞生物學(xué)活性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：牙周組織包括牙齦、牙周膜及礦化組織牙骨質(zhì)和牙槽骨，主要作用是支持穩(wěn)固牙齒。由于其組成的多樣性，使牙周組織愈合比一般的軟組織愈合更為復(fù)雜。成纖維細(xì)胞是牙齦結(jié)締組織和牙周膜的主要細(xì)胞類型，在牙周組織的形成與再生、完整性的維持及功能的實(shí)施中起重要作用。有研究認(rèn)為牙周膜細(xì)胞(periodontalligament cells，PDLCs)和牙齦成纖維細(xì)胞(gingival fibroblasts，GFs)雖然在光鏡下與掃描電鏡下觀察其在形

2、態(tài)上沒(méi)有區(qū)別，但在功能上具有明顯的差異：牙齦成纖維細(xì)胞主要與牙齦組織的自身穩(wěn)定有關(guān)，而牙周膜細(xì)胞除維持自身的穩(wěn)定外，還可分化成成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞參與鄰近牙槽骨和牙骨質(zhì)的改建及修復(fù)再生。目前尚缺乏明確的區(qū)別牙周膜細(xì)胞和牙齦成纖維細(xì)胞的細(xì)胞標(biāo)志物。 牙周病是人類常見病、多發(fā)病，發(fā)病率高達(dá)80％以上?；疾『蟪?dǎo)致牙周組織結(jié)構(gòu)破壞，牙周附著喪失、牙周袋形成、牙齒松動(dòng)甚至脫落，是導(dǎo)致成年人失牙的主要原因。牙周病手術(shù)治療后，牙周組織的愈

3、合趨向于牙周各種細(xì)胞成分的競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)，只有牙周膜細(xì)胞首先占據(jù)牙根面，才能形成真正意義的牙周組織再生；將體外培養(yǎng)的牙周膜細(xì)胞和牙齦成纖維細(xì)胞植入動(dòng)物體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)牙齦成纖維細(xì)胞不能形成新的牙周再生所需的各種組織，多為纖維性愈合，而牙周膜細(xì)胞則可形成再生性愈合。本實(shí)驗(yàn)采用體外原代培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞和牙齦成纖維細(xì)胞，四唑鹽比色法(MTT)比較二者的增殖特性、檢測(cè)堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性，免疫組化染色法對(duì)比兩

4、種細(xì)胞對(duì)于Ⅰ、Ⅲ型膠原、骨形成蛋白(bonemorphogenetic proteins,BMP)的表達(dá)情況，流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM)比較兩種細(xì)胞中BMP水平的表達(dá)。 為深入研究牙周組織中各種細(xì)胞的生物學(xué)特性、進(jìn)一步找出牙齦成纖維細(xì)胞和牙周膜細(xì)胞的鑒別標(biāo)志提供理論基礎(chǔ)，并為今后改良兩種細(xì)胞使其成為牙周組織工程的理想種子細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。 方法：采用組織塊法分離培養(yǎng)牙周膜細(xì)胞和牙齦成纖維細(xì)胞，測(cè)定二者的

5、增殖特性和ALP活性，利用免疫組化和FCM方法比較Ⅰ、Ⅲ型膠原、BMP的表達(dá)情況，以觀察對(duì)比兩種細(xì)胞的生物學(xué)特性的異同。 1 原代培養(yǎng)及傳代體外人牙周膜細(xì)胞原代培養(yǎng)：取臨床上12歲左右因正畸需要拔除的健康前磨牙，刮取牙根中1/3的牙周膜組織，利用組織塊法培養(yǎng)牙周膜細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿瓶底80％時(shí)進(jìn)行傳代。取第二代細(xì)胞爬片，鑒定細(xì)胞來(lái)源。 體外人牙齦成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)：取同一個(gè)體同一部位的齦乳頭組織，按上述相同方法進(jìn)行牙

6、齦成纖維細(xì)胞培養(yǎng)。 2 增殖活性的比較取第四代牙周膜細(xì)胞與牙齦成纖維細(xì)胞，以2×10<'4>/ml的細(xì)胞濃度接種于3個(gè)96孔培養(yǎng)板，10％DMEM(dulbecco’smodified eagle medium、)培養(yǎng)基共培養(yǎng)7 d，分別于第3、5、7d，各取出一個(gè)96孔板， MTT法于酶標(biāo)儀上492 nm波長(zhǎng)讀取A值。 3 ALP活性比較取第五代牙周膜細(xì)胞與牙齦成纖維細(xì)胞，以1×10<'5>/ml的細(xì)胞濃度接種于24孔

7、培養(yǎng)板，10％DMEM培養(yǎng)基共培養(yǎng)7 d，棄孔內(nèi)液體，加入Triton X-100，4℃過(guò)夜，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)：取上述各孔液體及空白對(duì)照的蒸餾水一并轉(zhuǎn)入另一96孔板。按ALP試劑盒說(shuō)明依次按比例加入緩沖液、基質(zhì)液，水浴，加入顯色劑后在酶標(biāo)儀上于410 nm波長(zhǎng)下測(cè)得OD值，間接反映細(xì)胞ALP活性。 4 免疫組化染色取第五、六代牙周膜細(xì)胞與牙齦成纖維細(xì)胞，以2×10<'5>/ml的細(xì)胞濃度接種于放有1×1cm<'2>大小蓋玻片的12孔

8、培養(yǎng)板中，加入10％DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)一周，95％乙醇固定后進(jìn)行免疫組化染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。 結(jié)果判定：細(xì)胞胞漿中有棕色顆粒為陽(yáng)性。以染色強(qiáng)度為判定標(biāo)準(zhǔn)，分為四級(jí)：無(wú)棕色顆粒記為(-)；僅有少量、細(xì)小、散在的棕色顆粒，著色較淺，記為(+)；棕色顆粒聚集成大顆粒記為(++)；顆粒密集成團(tuán)片狀，著色深棕，記為(+++)。 5 流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)取第六代牙周膜細(xì)胞與牙齦成纖維細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化吹散，計(jì)數(shù)細(xì)胞量達(dá)1×10<'6

9、>個(gè)以上，離心收集細(xì)胞，D-Hank's液洗兩次，70％乙醇固定同時(shí)吹散成單細(xì)胞懸液，上機(jī)進(jìn)行FCM檢測(cè)。 結(jié)果 1 人牙周膜細(xì)胞原代培養(yǎng)成功率為10％，牙齦成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)成功率為100％，倒置相差顯微鏡下觀察，5～10 d有細(xì)胞從組織塊周圍游出，放射狀排列，20 d細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底，原代及傳代培養(yǎng)的牙齦與牙周膜細(xì)胞在相差顯微鏡下形態(tài)相似，均為梭形，有2～3個(gè)胞漿突起，胞核呈圓形或橢圓形，核仁明顯。經(jīng)免疫組化鑒定波

10、形蛋白陽(yáng)性，細(xì)胞角蛋白陰性，符合成纖維樣細(xì)胞的特征。 2 加入MTT 4 h后，各孔內(nèi)均有紫黑色結(jié)晶形成，經(jīng)酶標(biāo)儀于492 nm處讀數(shù)，結(jié)果顯示牙齦成纖維細(xì)胞的A值明顯高于牙周膜細(xì)胞，P<0．01。 3 ALP檢測(cè)結(jié)果顯示，牙周膜細(xì)胞ALP的OD值高于牙齦成纖維細(xì)胞，P<0．01。 4 免疫組化染色：以陰性對(duì)照為參照，牙周膜細(xì)胞中I型膠原染色均為陽(yáng)性，(++)～(+++)，胞漿中充滿棕黃色大顆粒，核膜周圍染色較深

11、，而牙齦成纖維細(xì)胞為(+)，染色較弱，顆粒細(xì)小，胞漿淡黃色。Ⅲ型膠原的染色結(jié)果牙周膜細(xì)胞為陽(yáng)性，(++)～(+++)，牙齦成纖維細(xì)胞則著色較淡(+)。BMP在牙周膜細(xì)胞中深棕色顆粒密集成團(tuán)片狀，為(+++)，而牙齦成纖維細(xì)胞著色較淡，為(+)。5流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)：牙周膜細(xì)胞中BMP的熒光強(qiáng)度值高于牙齦成纖維細(xì)胞，P<0．01。 結(jié)論 1 與牙周膜細(xì)胞相比，牙齦成纖維細(xì)胞取材容易，原代培養(yǎng)成功率高，細(xì)胞增殖活性強(qiáng)，進(jìn)一步研究

12、后可作為牙周組織工程的種子細(xì)胞大量使用。 2 免疫組化染色顯示，Ⅰ、Ⅲ型膠原在體外培養(yǎng)的牙周膜細(xì)胞和牙齦成纖維細(xì)胞中的表達(dá)不同，牙周膜細(xì)胞表達(dá)均為中到強(qiáng)陽(yáng)性，而牙齦成纖維細(xì)胞中為弱陽(yáng)性，表明兩種細(xì)胞在膠原基質(zhì)合成方面存在差異。Ⅰ、Ⅲ型膠原可作為鑒別兩種細(xì)胞的標(biāo)志物。 3 牙周膜細(xì)胞表達(dá)的ALP活性高于牙齦成纖維細(xì)胞，免疫組化染色及FCM檢測(cè)均顯示牙周膜細(xì)胞的BMP表達(dá)高于牙齦成纖維細(xì)胞，ALP與BMP可作為鑒別兩種細(xì)胞的