大鼠生長相關蛋白基因重組腺相關病毒載體的構建.pdf

1、目的：應用分子生物學技術克隆大鼠生長相關蛋白(ratgrowthassociatedprotein-43，rGAP-43)的基因片段，并以腺相關病毒(adeno-associatedviresvector，AAV)為載體構建出rGAP-43的表達系統(tǒng)，為進一步研究rGAP-43對大鼠視網膜中各類細胞的作用奠定基礎，也為下一步進行基因治療的研究提供實驗依據。 方法：1．經RT-PCR法，獲得SD大鼠腦組織的cDNA文庫，設計引物，

2、從中擴增出GAP-43基因的開放讀碼框區(qū)(openreadingframe，ORF)基因片段，克隆入T載體，經DNA序列測定正確后，再大量擴增rGAP-43基因片段。 2．同時將報告基因一綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescenceprotein，EGFP)經SalI／BglII酶切后連接上經同樣酶切AAV-MCS多克隆載體，重組命名為AAV-EGFP,進行酶切鑒定與DNA序列測定。 3．將目的基因r

3、GAP-43經BamHI／SalI酶切后連接上經同樣酶切的含EGFP報告基因的AAV質粒載體(AAV-EGFP)。重組表達質粒命名為AAV-EGFP-rGAP-43，隨后針對重組表達質粒AAV-EGFP-rGAP-43進行酶切、DNA序列測定等結構上的鑒定。 4．將重組表達質粒及AAV轉染需要的輔助質粒pilelper、pAAV-RC經脂質體共轉染入培養(yǎng)好的AAV-293細胞，進行熒光表達的檢測以及病毒的包裝、病毒原液的收集及病

4、毒感染性滴度的測定等。 結果：1．克隆出的rGAP-43基因的ORF區(qū)片段以及構建的AAV-EGFP-rGAP-43重組表達質粒，兩者經DNA序列測定，所測序列與GeneBank檢索的完全一致。 2．重組表達質粒轉染后的AAV-293細胞可檢測到報告基因綠色熒光的表達，根據表達熒光的細胞數得到重組病毒的感染性滴度為10。particles／mi。 結論：1．應用分子生物學方法可以成功地克隆大鼠GAP-43基因并構