冷休克條件促進(jìn)紅色半胱氨酸脫硫酶形成的機(jī)制及其生理學(xué)意義的研究.pdf

1、目的：
　　半胱氨酸脫硫酶是一類(lèi)依賴(lài)磷酸吡哆醛的同質(zhì)二聚體酶，能夠催化底物L(fēng)-半胱氨酸脫硫生成L-丙氨酸及酶過(guò)硫化物中間物。大腸桿菌半胱氨酸脫硫酶IscS因含有輔因子PLP通常呈現(xiàn)黃色。本實(shí)驗(yàn)在課題組前期研究發(fā)現(xiàn)缺鐵環(huán)境和大腸桿菌雙敲除菌E.coli iscA-sufA-MC4100中過(guò)表達(dá)的IscS蛋白顏色為紅色的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)嵌合型半胱氨酸脫硫酶EH-IscS在15℃冷休克培養(yǎng)條件下過(guò)表達(dá)時(shí)也為紅色，且進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)富營(yíng)養(yǎng)化培養(yǎng)基聯(lián)

2、合冷休克培養(yǎng)條件可以產(chǎn)生在528 nm處具有明顯特征性吸收峰的紅色I(xiàn)scS。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析冷休克條件下大腸桿菌鐵硫簇組裝水平變化、培養(yǎng)基成分改變對(duì)紅色蛋白累積的影響以及黃色與紅色蛋白的活性差異，以探究冷休克條件下產(chǎn)生的紅色半胱氨酸脫硫酶形成的原因及生理意義。
　　方法：
　　1．構(gòu)建一種新的大腸桿菌冷休克助溶型表達(dá)質(zhì)粒pCold-SUMOa
　　以pE-SUMOproKan質(zhì)粒為模板，采用SUMO-F/R引物擴(kuò)增獲得S

3、UMO基因編碼框片段。以pCold TF質(zhì)粒為模板，采用pCold-F/R引物擴(kuò)增pCold質(zhì)粒骨架片段。采用無(wú)縫克隆技術(shù)將上述兩個(gè)片段連接獲得重組質(zhì)粒pCold-SUMOa。
　　2．表達(dá)半胱氨酸脫硫酶重組質(zhì)粒的構(gòu)建
　　(1)、構(gòu)建表達(dá)大腸桿菌半胱氨酸脫硫酶的重組質(zhì)粒
　　以大腸桿菌E.coli MC4100基因組為模板，擴(kuò)增IscS編碼框基因。Kpn I單酶切pCold I質(zhì)粒，然后采用無(wú)縫克隆技術(shù)構(gòu)建獲得重組質(zhì)

4、粒IscS-pCold I。
　　(2)、構(gòu)建表達(dá)人源半胱氨酸脫硫酶的重組質(zhì)粒
　　以NFS1(55-457)-pET28b質(zhì)粒為模板擴(kuò)增獲得含有編碼人源半胱氨酸脫硫酶55-457位氨基酸的基因序列，pCold I、pCold-GST、pCold-SUMOa和pCold TF質(zhì)粒單酶切后并膠回收酶切后載體片段。然后用無(wú)縫克隆技術(shù)將NFS1基因連接至單酶切后載體片段中，獲得NFS1-pCold I, NFS1-pCold-SU

5、MOa, NFS1-pCold-GST和NFS1-pCold TF重組質(zhì)粒。
　　(3)、構(gòu)建表達(dá)嵌合型半胱氨酸脫硫酶的重組質(zhì)粒
　　以EH-IscS-pET28質(zhì)粒為模板擴(kuò)增獲得EH-IscS基因， pCold I, pCold-GST， pCold-SUMOa和pCold TF質(zhì)粒單酶切后膠回收，采用無(wú)縫克隆技術(shù)分別將EH-IscS基因連接至上述四個(gè)單酶切后載體片段中，獲得 EH-IscS-pCold I, EH-Isc

6、S-pCold-GST, EH-IscS-pCold TF, EH-IscS-pCold-SUMOa重組表達(dá)質(zhì)粒。
　　(4)、構(gòu)建EH-IscS(K206A)-pCold-SUMOa和EH-IscS(C328S)-pCold-SUMOa突變質(zhì)粒
　　根據(jù)突變位點(diǎn)處的序列分別設(shè)計(jì)5′端包含互補(bǔ)同源臂序列的正向和反向突變引物，利用基于體外同源重組的無(wú)縫克隆技術(shù)的基因定點(diǎn)突變方法，構(gòu)建EH-IscS蛋白的第206位賴(lài)氨酸突變?yōu)楸?/p>

7、氨酸的EH-IscS(K206A)-pCold-SUMOa重組質(zhì)粒和第328位半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸的EH-IscS(C328S)-pCold-SUMOa重組質(zhì)粒，含有突變位點(diǎn)的重組質(zhì)粒送上海華大基因測(cè)序。
　　3.重組半胱氨酸脫硫酶的純化與分析(1)重組半胱氨酸脫硫酶的分離與純化
　　15℃培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)表達(dá) IscS, EH-IscS, GST-EH-IscS, TF-EH-IscS, TF-NFS1(55-457), S

8、UMO-NFS1(55-457), SUMO-EH-IscS蛋白，經(jīng)Ni柱親和層析純化和 G-25脫鹽以獲取目的蛋白。純化后的蛋白進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描分析和SDS-PAGE電泳分析。
　　(2)重組半胱氨酸脫硫酶活性的測(cè)定
　　將純化好的蛋白樣品與L-半胱氨酸、DTT在37℃條件下進(jìn)行孵育，IscS可催化底物L(fēng)-半胱氨酸脫硫，在DTT存在的條件下形成不穩(wěn)定的硫化氫，硫化氫與FeCl3相互作用，在DPD作為顯色劑的情況下生成藍(lán)色絡(luò)合

9、物在669nm處有特異的吸收峰，利用公式及硫的消光系數(shù)可得出蛋白中硫的含量，硫含量的多少可以直接反映蛋白活性的高低。
　　(3)重組半胱氨酸脫硫酶穩(wěn)定性的分析
　　使DB將純化好的IscS, EH-IscS, GST-EH-IscS, SUMO-EH-IscS和TF-EH-IscS蛋白濃度分別稀釋為1μM，37℃孵育30 min，每隔5min測(cè)定蛋白樣品在320 nm處的吸光值。如果蛋白樣品會(huì)發(fā)生自我凝集，320nm處吸光值

10、就會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而遞增。
　　4.15℃冷休克培養(yǎng)條件下大腸桿菌體內(nèi)IscS紅色中間物的累積分析
　　IscS, EH-IscS, SUMO-EH-IscS, TF-EH-IscS蛋白在15℃條件下分別誘導(dǎo)24h、48h、72h，收集的菌體破碎后經(jīng)Ni柱親和層析純化和G-25脫鹽以獲取目的蛋白。純化后的蛋白進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描分析和SDS-PAGE電泳分析。
　　5.冷休克培養(yǎng)條件下，鐵螯合劑對(duì)紅色反應(yīng)物生成的影響分析

11、r>　　IscS-pCold I/BL21(DE3)菌體在37℃條件下培養(yǎng)至OD值為0.3-0.4時(shí)，加入鐵螯合劑，15℃靜置30min，加入IPTG誘導(dǎo)劑，15℃培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)24h，蛋白質(zhì)經(jīng)Ni柱親和脫鹽純化。純化后的蛋白用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描分析，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。
　　6.冷休克培養(yǎng)條件對(duì)大腸桿菌中[4Fe-4S]簇和[2Fe-2S]簇組裝的影響分析
　　Nth-pBAD/E. col

12、i BL21(DE3), SoxR-pBAD/E. coli BL21(DE3)蛋白在37℃和25℃培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)表達(dá)；Nth-pCold I/E. coli BL21(DE3), SoxR-pCold I/E. coli BL21(DE3)在25℃和15℃培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)表達(dá)。蛋白質(zhì)經(jīng)Ni柱親和脫鹽純化。純化后的蛋白用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描分析，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。
　　7.15℃冷休克培養(yǎng)條件下鐵硫簇組裝

13、相關(guān)基因的缺失對(duì)紅色反應(yīng)物生成的影響分析
　　在15℃冷休克培養(yǎng)條件下，通過(guò)在存在不同程度鐵硫簇組裝障礙的大腸桿菌突變菌△iscU、△isc和△iscA△sufA中誘導(dǎo)表達(dá)IscS，經(jīng)Ni柱親和層析純化和G-25脫鹽以獲取目的蛋白。純化后的蛋白進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描和SDS-PAGE電泳分析。
　　8.富營(yíng)養(yǎng)化培養(yǎng)基聯(lián)合冷休克條件對(duì)大腸桿菌紅色反應(yīng)物產(chǎn)生的影響
　　在15℃和25℃培養(yǎng)條件下，用不同的培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá)IscS蛋白

14、，經(jīng)Ni柱親和層析純化和G-25脫鹽以獲取目的蛋白。純化后的蛋白進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描分析和SDS-PAGE電泳分析。
　　9.紅色反應(yīng)物穩(wěn)定性的分析
　　IscS-pBAD/E. coli BL21(DE3)在37℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)，IscS-pCold I/E. coli BL21(DE3)用含有0.4mM2,2-dipyridyl的LB培養(yǎng)基在15℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)，然后分別將純化出來(lái)的黃色和紅色I(xiàn)scS與10mM L-半胱氨酸在

15、4℃孵育20min，之后進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描；在反應(yīng)體系中加入DTT，然后對(duì)蛋白進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描分析。
　　10.紅色反應(yīng)物與半胱氨酸脫硫酶活性的關(guān)系分析
　　突變蛋白 IscS-pBAD-K206A/BL21(DE3)， IscS-pBAD-C328S/BL21(DE3), EH-IscS-K206A-pCold-SUMOa/BL21(DE3)， EH-IscS-C328S--pCold-SUMOa/BL21(DE3)在15℃培養(yǎng)

16、條件下誘導(dǎo)表達(dá)并純化，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描分析。
　　11.紅色I(xiàn)scS蛋白與黃色I(xiàn)scS蛋白活性的比較
　　誘導(dǎo)的紅色I(xiàn)scS和黃色I(xiàn)scS與PLP（終濃度為200μM）室溫孵育1 h，脫鹽去除剩余的PLP，然后取等摩爾濃度的黃色和紅色I(xiàn)scS(10μM)檢測(cè)兩者的半胱氨酸脫硫酶活性。
　　結(jié)果：
　　1.表達(dá)半胱氨酸脫硫酶重組質(zhì)粒的構(gòu)建
　　利用無(wú)縫克隆和菌落PCR技術(shù)，我們成功地構(gòu)建了

17、冷休克助溶型表達(dá)載體pCold-SUMOa，表達(dá)大腸桿菌半胱氨酸脫硫酶的重組質(zhì)粒IscS-pCold I，表達(dá)人源半胱氨酸脫硫酶的重組質(zhì) NFS1-pColdI, NFS1-pCold-SUMOa, NFS1-pCold-GST, NFS1-pCold TF，表達(dá)嵌合型半胱氨酸脫硫酶的重組質(zhì)粒EH-IscS-pColdI, EH-IscS-pCold-GST, EH-IscS-pColdTF, EH-IscS-pCold-SUMOa,突

18、變重組質(zhì)粒 EH-IscS(K206A)-pCold-SUMOa, EH-IscS(C328S)-pCold-SUMOa，并且測(cè)序結(jié)果也顯示以上重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　2.重組半胱氨酸脫硫酶蛋白的純化與分析
　　SDS-PAGE分析表明純化獲得的重組半胱氨酸脫硫酶的蛋白純度都高于90％。構(gòu)建的冷休克助溶表達(dá)載體pCold-SUMOa可以提高EH-IscS蛋白的可溶性、穩(wěn)定性和活性。且發(fā)現(xiàn)15℃冷休克條件下誘導(dǎo)表達(dá)的EH-Is

19、cS為淡紅色，全波長(zhǎng)掃描可以看到在528nm處有微弱的特征性吸收峰。
　　3.冷休克培養(yǎng)條件下紅色半胱氨酸脫硫酶會(huì)在大腸桿菌體內(nèi)累積
　　15℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)的IscS, EH-IscS, SUMO-EH-IscS, TF-EH-IscS蛋白目的條帶單一，且發(fā)現(xiàn)隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加蛋白顏色逐漸由黃變紅，且在528nm處的特征性吸收峰也逐漸升高。
　　4.冷休克條件可以促進(jìn)缺鐵環(huán)境中紅色I(xiàn)scS的產(chǎn)生
　　15℃冷休

20、克條件下，在普通LB培養(yǎng)基中加入0.1mM的鐵螯合劑dipyridyl即可使誘導(dǎo)表達(dá)IscS蛋白變紅，且隨著dipyridyl濃度的增加蛋白紅色加深，528nm處的吸收峰也逐漸上升。
　　5.冷休克條件下紅色反應(yīng)物的產(chǎn)生與大腸桿菌中鐵硫簇組裝障礙有關(guān)
　　誘導(dǎo)表達(dá)純化的Nth-[4Fe-4S]和SoxR-[2Fe-2S]蛋白進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，分析發(fā)現(xiàn)25℃培養(yǎng)條件會(huì)抑制抑制大腸桿菌[4Fe-4S]簇的組裝，而不抑制[2Fe-2

21、S]簇的組裝，15℃培養(yǎng)條件下，大腸桿菌[4Fe-4S]簇和[2Fe-2S]簇的組裝均受到抑制。在15℃冷休克培養(yǎng)條件下，從存在不同程度鐵硫簇組裝障礙的大腸桿菌突變菌△iscU、△isc和△iscA△sufA中純化的IscS都呈紅色，且在528nm處也出現(xiàn)了特征性的吸收峰。
　　6.2× LB和1×TB培養(yǎng)基聯(lián)合15℃冷休克培養(yǎng)條件，都會(huì)促進(jìn)紅色I(xiàn)scS的產(chǎn)生
　　25℃條件下，2× LB和1× TB培養(yǎng)基誘導(dǎo)純化出來(lái)的大腸

22、桿菌IscS均為黃色，而15℃條件下誘導(dǎo)的大腸桿菌IscS卻為紅色，且有528nm處的特征性吸收峰。發(fā)現(xiàn)15℃條件下只有增加培養(yǎng)基中酵母膏的含量才會(huì)促進(jìn)大腸桿菌紅色I(xiàn)scS的產(chǎn)生。
　　7.紅色反應(yīng)物穩(wěn)定性的分析
　　將大腸桿菌IscS與L-半胱氨酸在體外孵育會(huì)導(dǎo)致IscS在395 nm處吸收峰消失，而紅色I(xiàn)scS在528 nm處吸收峰卻沒(méi)有變化；當(dāng)在反應(yīng)體系中加入DTT以后，隨著酶促反應(yīng)的進(jìn)行，紅色I(xiàn)scS在528 nm處

23、吸收峰也沒(méi)有變化。
　　8.紅色反應(yīng)物的生成依賴(lài)蛋白的活性且紅色反應(yīng)物會(huì)抑制半胱氨酸脫硫酶的活性
　　全波長(zhǎng)掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)純化的含突變位點(diǎn)的蛋白均呈黃色，也無(wú)528nm的特征性吸收峰；且當(dāng)冷休克條件下表達(dá)的紅色I(xiàn)scS和野生型黃色I(xiàn)scS具有相同濃度和PLP結(jié)合量的情況下，發(fā)現(xiàn)紅色蛋白的活性明顯低于黃色蛋白。
　　結(jié)論：
　　1.構(gòu)建的冷休克助溶型表達(dá)質(zhì)粒pCold-SUMOa能夠提高重組蛋白質(zhì)EH-IscS的溶解

24、度、活性和穩(wěn)定性；
　　2.發(fā)現(xiàn)在15℃冷休克培養(yǎng)條件下表達(dá)的重組半胱氨酸脫硫酶EH-IscS為淡紅色，且隨著時(shí)間的增加紅色反應(yīng)物會(huì)在大腸桿菌體內(nèi)累積，冷休克培養(yǎng)條件可以促進(jìn)紅色蛋白的產(chǎn)生；
　　3.25℃培養(yǎng)條件會(huì)抑制大腸桿菌[4Fe-4S]簇的組裝，而不抑制[2Fe-2S]簇的組裝，15℃培養(yǎng)條件下大腸桿菌[4Fe-4S]簇和[2Fe-2S]簇的組裝均受到抑制，冷休克條件下，鐵硫簇組裝障礙的大腸桿菌突變菌純化的IscS都

25、呈紅色，說(shuō)明冷休克條件下該紅色物質(zhì)的產(chǎn)生與鐵硫簇組裝障礙有關(guān)；
　　4.2× LB和1× TB培養(yǎng)基聯(lián)合15℃冷休克培養(yǎng)條件，都會(huì)促進(jìn)紅色I(xiàn)scS的累積，并且進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中只有增加酵母膏含量才會(huì)促進(jìn)紅色I(xiàn)scS的累積；5.15℃冷休克條件下表達(dá)的含突變位點(diǎn)的蛋白沒(méi)有變紅也無(wú)528nm吸收峰，說(shuō)明該紅色反應(yīng)物與蛋白的活性相關(guān)，只有有活性的蛋白才會(huì)有紅色物質(zhì)的產(chǎn)生；6.生理狀態(tài)下，紅色中間產(chǎn)物一旦形成就會(huì)穩(wěn)定存在；當(dāng)紅色I(xiàn)scS和