釉基質(zhì)蛋白對成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及其對兔耳創(chuàng)面愈合影響的實驗研究.pdf

1、皮膚軟組織缺損后的創(chuàng)面修復(fù)是整形外科中經(jīng)常遇到的問題。創(chuàng)面愈合過程涉及一系列細(xì)胞和細(xì)胞因子之間的相互作用，尋找能夠促進創(chuàng)面愈合的新型藥物是科研的主要目的。釉基質(zhì)蛋白（EMPs）已廣泛應(yīng)用于促進牙周組織再生的治療，具有肯定的療效。然而，釉基質(zhì)蛋白對皮膚軟組織缺損愈合影響的研究尚少。本研究分別將釉基質(zhì)蛋白作用于體外培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞，觀察其對這兩種傷口愈合過程中主要參與細(xì)胞的生物學(xué)性質(zhì)的影響，然后將釉基質(zhì)蛋白應(yīng)用于兔耳創(chuàng)面模型

2、，觀察其對皮膚創(chuàng)面愈合的影響。實驗方法和結(jié)果概述如下：
　　1、釉基質(zhì)蛋白對成纖維細(xì)胞生物學(xué)性質(zhì)的影響
　　取包皮環(huán)切術(shù)后人包皮組織，采用組織塊法培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞。取3～6代細(xì)胞進行實驗。配置不同濃度的EMPs工作液，使EMPs終濃度分別為25、50、100和200μg/mL。
　　①細(xì)胞黏附實驗中，取細(xì)胞以106/ml濃度接種于預(yù)鋪不同濃度EMPs的96孔培養(yǎng)板，每孔加0.2ml，作為實驗組（EP1、EP2、EP

3、3、EP4組）；取0.2ml相同濃度細(xì)胞懸液加入未預(yù)鋪EMPs的板孔作為對照組。分別于細(xì)胞接種1.5、3和4.5h后洗去未黏附細(xì)胞，用MTT比色法測定黏附細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果顯示，各時間點EP2、EP3、EP4組與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，EP1組與對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　?、诩?xì)胞增殖實驗中,以不同濃度的EMPs工作液再懸細(xì)胞至終濃度為5×104/ml加入96孔培養(yǎng)板，每孔加0.2ml作為實驗組（EP1、E

4、P2、EP3、EP4組）；取0.2ml相同密度不含EMPs的細(xì)胞懸液加入96孔板作為對照組。分別于細(xì)胞接種后2、4、6、8天用MTT比色法測定細(xì)胞的數(shù)量。在第2天，各組之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；第4天，EP2、EP3、EP4實驗組吸光度值高于對照組(P<0.05)，EP1組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；第6天，EP2、EP3、EP4實驗組與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，EP1組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；第8天，E

5、P2、EP3實驗組同對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，EP1、EP4組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　?、邰裥湍z原前mRNA合成測定實驗中，以不同濃度的EMPs工作液再懸細(xì)胞至終濃度為106/ml濃度置于6孔培養(yǎng)板，每孔加2ml，作為實驗組（EP1、EP2、EP3、EP4組）；取2ml相同密度不含EMPs的細(xì)胞懸液加入6孔板作為對照組。培養(yǎng)第5天終止培養(yǎng)，以RT-PCR法測定Ⅰ型膠原前mRNA合成量。結(jié)果顯示，EP2、EP

6、3、EP4組Ⅰ型膠原前mRNA合成量高于對照組。
　　2、釉基質(zhì)蛋白對角質(zhì)形成細(xì)胞生物學(xué)性質(zhì)的影響
　　取包皮環(huán)切術(shù)后人包皮組織，采用消化法培養(yǎng)人角質(zhì)形成細(xì)胞。取第3代細(xì)胞進行實驗。配置不同濃度的EMPs工作液，使EMPs終濃度分別為25、50、100和200μg/mL。
　?、偌?xì)胞黏附性實驗中，取細(xì)胞以6×104/ml密度接種于預(yù)鋪不同濃度EMPs的96孔培養(yǎng)板，每孔加0.2ml，作為實驗組（EP1、EP2、EP3、

7、EP4組）；取0.2ml相同密度細(xì)胞懸液加入未預(yù)鋪EMPs的板孔作為對照組。分別于細(xì)胞接種1.5、3、4.5和6h后吸去未黏附細(xì)胞，用MTT比色法測定黏附細(xì)胞數(shù)量。1.5h時，各實驗組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；3h時，EP2組與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，EP1、EP3、EP4組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；4.5h時，EP2、EP3、EP4組與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，EP1組與對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。6h時，

8、EP3、EP4組與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，EP1、EP2組與對照組差別無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　②細(xì)胞增殖實驗中,以不同濃度的EMPs工作液再懸細(xì)胞至終濃度為4×104/ml加入96孔培養(yǎng)板，每孔加0.2ml作為實驗組（EP1、EP2、EP3、EP4組）；取0.2ml相同密度不加EMPs細(xì)胞懸液加入96孔板作為對照組。分別于細(xì)胞接種后2、4、6、8天用MTT比色法測定細(xì)胞的量。各時間點各組之間差別均無統(tǒng)計學(xué)意義。

9、　?、奂?xì)胞體外劃痕實驗中，以不同濃度的EMPs工作液再懸細(xì)胞至終濃度為2×105濃度置于12孔培養(yǎng)板，每孔加2ml,作為實驗組（EP1、EP2、EP3、EP4組）；取2ml相同密度不加EMPs細(xì)胞懸液加入12孔板作為對照組。培養(yǎng)過程中，細(xì)胞培養(yǎng)液中均加入5ug/ml的絲裂霉素C以抑制細(xì)胞增殖。24小時后用體外劃痕法測定體外創(chuàng)面的愈合率。各實驗組與對照組愈合率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3、釉基質(zhì)蛋白對兔耳創(chuàng)面愈合的影響
　　選取

10、日本大耳白兔5只，每側(cè)兔耳制作直徑1cm大小創(chuàng)面4個。術(shù)后每天以1.5mg/cm2EMPs+載體涂抹左耳創(chuàng)面，設(shè)為EMPs治療組，右耳創(chuàng)面僅涂抹載體作為對照組。觀察創(chuàng)面愈合情況并于術(shù)后即時及3、6、9、12、15天照相，應(yīng)用ImageJ圖像分析軟件測量未愈合創(chuàng)面面積，以下面公式計算創(chuàng)面愈合率:愈合率=(原始創(chuàng)面面積-現(xiàn)有創(chuàng)面面積/原始創(chuàng)面面積)×100％。當(dāng)愈合率大于90％時判定為創(chuàng)面愈合。記錄各創(chuàng)面愈合時間。第3、6天治療組和對照組間

11、差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，第9、12、15天治療組創(chuàng)面愈合率高于對照組(P<0.05)。治療組平均愈合時間為11.4±0.95天，對照組平均愈合時間為15.6±0.82天，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　通過本實驗研究，可以認(rèn)為釉基質(zhì)蛋白有促進皮膚創(chuàng)面愈合的作用。它可以促進成纖維細(xì)胞的粘附、增殖及Ⅰ型膠原前mRNA合成；對角質(zhì)形成細(xì)胞則僅能促進其粘附，對其增殖、遷移則無明顯作用。由此推測，主要是成纖維細(xì)胞參與了釉基質(zhì)蛋白促進