釉基質(zhì)蛋白和骨形成蛋白影響牙周膜細(xì)胞生物學(xué)功能的研究.pdf

1、釉基質(zhì)蛋白是釉質(zhì)發(fā)育過程中未礦化釉質(zhì)中含有的蛋白成分，研究發(fā)現(xiàn)它還可以由赫特威氏上皮根鞘內(nèi)層細(xì)胞合成，并參與牙骨質(zhì)的形成。近幾年將其引入牙周病治療領(lǐng)域，豐富了牙周病的治療手段。與牙周病治療的其它手段相比，應(yīng)用釉基質(zhì)蛋白更接近牙周組織的理想愈合方式。但是，其機(jī)理還不清楚，這也是國內(nèi)外牙周病治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。 骨形成蛋白是一種重要的誘骨分化因子，能誘導(dǎo)未分化間充質(zhì)細(xì)胞不可逆地分化為軟骨和骨組織，從而導(dǎo)致新骨形成。骨形成蛋白也被

2、應(yīng)用于牙周病治療領(lǐng)域，能誘導(dǎo)牙周組織中未分化間充質(zhì)細(xì)胞分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞，牙周膜組織及細(xì)胞中有骨形成蛋白分布，骨形成蛋白還可促進(jìn)PDLCs增殖，升高PDLCs的堿性磷酸酶活性。與合適的載體相復(fù)合，植入牙周缺損區(qū)可明顯刺激新生骨，使缺損區(qū)極快形成軟骨，爾后形成新骨和牙骨質(zhì)。這與牙周組織缺損的愈合基本接近。 牙周組織缺損最理想的愈合方式是達(dá)到牙槽骨、牙骨質(zhì)和牙周膜的完全功能性再生。牙周膜中的細(xì)胞是牙周組織代謝和生理改建的主

3、要細(xì)胞成分，其中牙周膜成纖維細(xì)胞可以形成牙周膜中粗大的纖維束，成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞則分別形成牙槽骨和牙骨質(zhì)，這些細(xì)胞成分依靠牙周膜中的未分化間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行更新和補(bǔ)充。一般認(rèn)為，牙周膜細(xì)胞是使牙周組織獲得再生的基礎(chǔ)，是牙周組織再生的主要細(xì)胞來源。但在牙周病損部位，PDLCs的來源非常有限，以致牙周組織很難達(dá)到有效地再生和重建，而組織工程技術(shù)有望解決這一難題。組織工程學(xué)是近年來發(fā)展起來的一門新學(xué)科，其基本方法是將體外培養(yǎng)的高濃度的功能相關(guān)

4、的活細(xì)胞種植到具有一定空間結(jié)構(gòu)的三維支架上，再將此細(xì)胞支架復(fù)合物植入體內(nèi)或在體外繼續(xù)培養(yǎng)，通過細(xì)胞之間的相互粘附、生長繁殖分泌細(xì)胞外基質(zhì)，從而形成具有一定結(jié)構(gòu)和功能的組織或器官，以達(dá)到修復(fù)創(chuàng)傷和重建功能的目的。 因此，研究釉基質(zhì)蛋白和骨形成蛋白對牙周膜細(xì)胞功能的影響將有助于我們了解牙周組織再生的機(jī)理，為組織工程在牙周疾病治療方面的應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 基于以上原因，本論文進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)：一、釉基質(zhì)蛋白和骨形成蛋白對人牙周膜

5、細(xì)胞增殖的影響本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞培養(yǎng)、MTT比色法，檢測了不同濃度的釉基質(zhì)蛋白和骨形成蛋白單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用對人PDLCs增殖的影響，測因子作用后第3、7天OD值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以進(jìn)一步觀察分析釉基質(zhì)蛋白和骨形成蛋白促人PDLCs增殖的作用及其可能作用機(jī)理。結(jié)果表明：3天內(nèi)、7天內(nèi)以及3-7天時間段內(nèi)結(jié)果基本相似，釉基質(zhì)蛋白和骨形成蛋白單獨(dú)應(yīng)用均可促進(jìn)人PDLCs增殖，兩者聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用。釉基質(zhì)蛋白和骨形成蛋白的促增殖作用呈劑量依賴性，骨

6、形成蛋白以100ug/L作用較佳，釉基質(zhì)蛋白以100mg/L，作用較佳。且釉基質(zhì)蛋白對人PDLCs促增殖作用不如骨形成蛋白。 二、不同誘導(dǎo)條件對人牙周膜細(xì)胞堿性磷酸酶活性及形成礦化結(jié)節(jié)的影響本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞培養(yǎng)、堿性磷酸酶活性檢測法，檢測了100ug/L骨形成蛋白和100mg/L釉基質(zhì)蛋白對人牙周膜細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響，測因子作用后第3、7天OD值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并與傳統(tǒng)的礦化誘導(dǎo)液進(jìn)行對比，觀察因子作用后細(xì)胞堿性磷酸酶活性變

7、化。結(jié)果表明：堿性磷酸酶活性均明顯升高，礦化誘導(dǎo)作用最強(qiáng)；骨形成蛋白基本與礦化誘導(dǎo)保持持平；釉基質(zhì)蛋白組3天點(diǎn)時，堿性磷酸酶活性與對照組相比，明顯升高，與礦化誘導(dǎo)組差異不顯著。但7天點(diǎn)與3-7天時間段內(nèi)與對照組相比，細(xì)胞堿性磷酸酶活性升高不明顯。提示釉基質(zhì)蛋白骨誘導(dǎo)能力要低于骨形成蛋白，或者釉基質(zhì)蛋白不是骨誘導(dǎo)因子而是一種成骨促進(jìn)因子。 本實(shí)驗(yàn)還用Von-Kossa染色方法，觀察100ug/L骨形成蛋白和100mg/L釉基質(zhì)蛋白

8、作用于人牙周膜細(xì)胞后的礦化結(jié)節(jié)形成情況。結(jié)果表明：骨形成蛋白和釉基質(zhì)蛋白都能夠促使人牙周膜細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)，骨形成蛋白強(qiáng)于釉基質(zhì)蛋白，這不僅與骨形成蛋白和釉基質(zhì)蛋白本身所具有的提高細(xì)胞堿性磷酸酶活性的能力有關(guān)，還可能與它們的促增殖作用有關(guān)。雖然牙周膜細(xì)胞具有異質(zhì)性，體外培養(yǎng)時既能表現(xiàn)出成纖維細(xì)胞的特性，又能表現(xiàn)出成骨細(xì)胞和(或)成牙骨質(zhì)細(xì)胞的特性，具備成骨傾向，但對照組在未用因子誘導(dǎo)的情況下，只出現(xiàn)細(xì)胞的復(fù)層化生長，未出現(xiàn)礦化結(jié)節(jié)。提示

9、牙周膜細(xì)胞的復(fù)層生長并不是礦化的唯一決定因素，礦化過程可能還有其它因素的參與，必須加入礦化液或生長因子才能實(shí)現(xiàn)。 三、不同誘導(dǎo)條件對人牙周膜細(xì)胞合成非膠原蛋白的影響非膠原基質(zhì)蛋白包括骨橋蛋白、骨涎蛋白、骨粘連蛋白和骨鈣素等。骨和牙槽骨等硬組織依靠非膠原基質(zhì)蛋白和膠原性支架將鈣和磷酸根離子網(wǎng)絡(luò)起來，形成礦化結(jié)構(gòu)，由于它們與骨的代謝與改建有密切關(guān)系，所以又將它們稱為骨相關(guān)蛋白。而牙骨質(zhì)附著蛋白是從牙骨質(zhì)中提取的一種與牙骨質(zhì)形成有關(guān)的

10、一種特異性活性蛋白。本實(shí)驗(yàn)利用免疫組織化學(xué)方法和圖像分析方法直接檢測了人牙周膜細(xì)胞胞漿內(nèi)合成的骨橋蛋白、骨涎蛋白、骨粘連蛋白和牙骨質(zhì)附著蛋白在100mg/L釉基質(zhì)蛋白和100ug/L骨形成蛋白作用下的變化。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：hPDLCs在正常培養(yǎng)條件下可以低水平表達(dá)OPN和BSP，基本不表達(dá)ON，提示體外培養(yǎng)的人牙周膜細(xì)胞本身即具有成骨樣表型。在因子作用下，細(xì)胞OPN、ON、BSP的表達(dá)量增高，尤其是經(jīng)典的礦化培養(yǎng)液，BMP-2其