外用細(xì)菌纖維素對(duì)兔耳創(chuàng)面愈合影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、纖維素是廣泛分布于地球的生物聚合物,植物(如樹木、苧麻、棉花等)中其含量十分豐富,是細(xì)胞壁的主要成分,也是諸多真菌、藻類的主要成分。但近年發(fā)現(xiàn)一些細(xì)菌也能產(chǎn)生纖維素,其結(jié)構(gòu)、理化特性和生化特性等皆與植物纖維素有較大的差異。根據(jù)國(guó)外學(xué)者文獻(xiàn)報(bào)道:細(xì)菌也能產(chǎn)生纖維素,這最早是由Brown于19世紀(jì)80年代末首次報(bào)道的。與植物纖維相比,細(xì)菌纖維素是目前最細(xì)的天然纖維,屬納米級(jí)纖維,大小僅為人工合成纖維的1/10,它已作為一種新興的生物材料受到

2、科學(xué)界的廣泛關(guān)注。因?yàn)檫@種纖維素是由細(xì)菌產(chǎn)生,所以這種纖維素被稱為細(xì)菌纖維素(Bacterial Cellulose,簡(jiǎn)稱BC),又被稱為微生物纖維素(microbial cellulose)。人們發(fā)現(xiàn)BC已經(jīng)將近120年,但是真正開始研究不過(guò)是近來(lái)不到20年的事情。目前主要集中在木醋桿菌(英文名:Acetobacter xylinum革蘭氏陰性桿菌屬)的研究,因其產(chǎn)量最高,研究最多。天然纖維素有Ⅰ,Ⅱ兩種分型,根據(jù)X-射線分析,木醋桿

3、菌所產(chǎn)生的纖維素屬于Ⅰ型。木醋桿菌纖維素的產(chǎn)生過(guò)程大致是:細(xì)胞壁上約有50～80個(gè)孔,由里往外分泌纖維素,先由直鏈多糖聚合成膠狀聚合物,然后再由上述聚合物形成走向與菌體長(zhǎng)軸平行的纖維束。
　　 世界各國(guó)的廣泛重視生物醫(yī)學(xué)材料,目前對(duì)細(xì)菌纖維素的研究主要集中在附加值較高的醫(yī)學(xué)生物材料上,例如組織工程支架、骨支架、軟骨支架、人工血管、人工皮膚以及藥物載體等方面。在我國(guó),人們對(duì)細(xì)菌纖維素的了解和認(rèn)識(shí)還不足,對(duì)其研究尚處于初級(jí)階段,大部

4、分集中在食品、食品添加劑和造紙應(yīng)用等方面,在生物醫(yī)用材料上的開發(fā)應(yīng)用上相關(guān)報(bào)道較少。細(xì)菌纖維素由于具有獨(dú)特的生物親和性、生物相容性、生物可降解性、生物適應(yīng)性和無(wú)過(guò)敏反應(yīng),以及高的持水性和結(jié)晶度、良好的納米纖維網(wǎng)絡(luò)、高的張力和強(qiáng)度,尤其是良好的機(jī)械韌性。因此在組織工程支架、人工血管、人工皮膚以及治療皮膚損傷等方面具有廣泛的用途,是國(guó)際生物醫(yī)用材料研究的熱點(diǎn)之一。細(xì)菌纖維素生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單,不含毒性物質(zhì),費(fèi)用低。具有良好的生物適應(yīng)性,很好的韌性

5、強(qiáng)度和水合度,有利于皮膚組織生長(zhǎng)和限制感染。這些都是作為燒傷患者和慢性皮膚潰爛患者的生物敷料及臨時(shí)皮膚的有利條件。
　　 目的：
　　 細(xì)菌纖維素(Bacterial Cellulose,BC)具有獨(dú)特的生物親和性、相容性和高度的持水性。通過(guò)建立兔耳創(chuàng)面愈合模型,外用BC于兔耳創(chuàng)面,觀察BC能否促進(jìn)成纖維細(xì)胞的移動(dòng)和增生,抑制其分化,從而影響膠原沉積。通過(guò)隨機(jī)、平行、對(duì)照觀察進(jìn)一步了解其對(duì)創(chuàng)面愈合的影響。
　　

6、方法：
　　 取4月齡新西蘭白兔18只,雌雄不限,體重2.0～2.5kg。戊巴比妥于耳緣靜脈緩慢推注麻醉后(1.0 ml/kg),兔耳背、腹側(cè)面皮膚碘伏、酒精消毒,用彈簧分規(guī)于游標(biāo)卡尺量取半徑0.5cm,于兔耳腹側(cè)皮膚表面刻畫出6個(gè)直徑為1cm的圓,內(nèi)外側(cè)各3個(gè),間隔1.5cm,切除圓內(nèi)皮膚,保留軟骨膜及軟骨。根據(jù)所用敷料不同,隨機(jī)將216個(gè)創(chuàng)面分為6組,每組36個(gè)創(chuàng)面。分別用紗布、BC(1:5)、BC(1:6)、BC(1:8)

7、、納米銀、油紗敷料覆蓋創(chuàng)面,作為A、B、C、D、E、F組。術(shù)后3、7、10、14、18、28 d取創(chuàng)面標(biāo)本行組織學(xué)及免疫組織化學(xué)染色觀察成纖維細(xì)胞、炎性細(xì)胞等,并檢測(cè)標(biāo)本中羥脯氨酸(hydroxyproline,Hpr)含量；取材時(shí)間點(diǎn)為28 d的36個(gè)兔耳創(chuàng)面,術(shù)后觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況；于術(shù)后0、2、4、6、8、10 d大體觀察創(chuàng)面愈合情況,記錄愈合時(shí)間及殘余創(chuàng)面比率。
　　 結(jié)果：
　　 1.一般情況
　　

8、術(shù)后對(duì)兔耳的包扎固定良好,未引起兔耳壞死、感染,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全部存活至實(shí)驗(yàn)取材完成,滿足實(shí)驗(yàn)要求。
　　 2.觀察大體形態(tài)學(xué)及平均愈合時(shí)間
　　 實(shí)驗(yàn)組(B、C、D)術(shù)后4 d可以看到明顯的肉芽組織生長(zhǎng),呈玻璃樣透明的細(xì)顆粒狀,鮮紅透亮,柔軟濕潤(rùn),觸之易出血,生長(zhǎng)速度很快,第3～7 d雖然沒有見到明顯的創(chuàng)面收縮,但有新生的毛細(xì)血管長(zhǎng)入,肉芽組織已經(jīng)生長(zhǎng)豐富,在8～12 d創(chuàng)面迅速縮小,甚至愈合,效果非常明顯,且未見感染,創(chuàng)區(qū)

9、干凈,抑菌效果非常好,且愈合后創(chuàng)面平整,基本看不到瘢痕。創(chuàng)面A肉芽組織生長(zhǎng)較慢,淡紅色,創(chuàng)面分泌物少,大約從第5 d開始創(chuàng)面逐漸縮小,先收縮創(chuàng)面,然后不斷生成肉芽組織,偶有細(xì)菌感染。創(chuàng)面E呈現(xiàn)綠色(敷料染色皮膚組織),比較干燥,滲液少,無(wú)感染跡象,抑菌效果較好。創(chuàng)面F愈合有延遲現(xiàn)象,長(zhǎng)期貼敷不更換,容易出現(xiàn)感染,愈合速度比各組稍慢。A～F組創(chuàng)面愈合時(shí)間分別為A組(13.0±1.5)、B組(12.0±0.9)、C組(13.3±1.0)、D

10、組(10.2±0.8)、E組(16.5±1.0)、F組(18.7±2.6)d,各組間愈合時(shí)間有顯著性差異(P<0.001),創(chuàng)面愈合時(shí)間B、C、D組較E、F組短,D組較A組短。
　　 3.觀察殘余創(chuàng)面比率
　　 根據(jù)Matlab圖形處理軟件,編制計(jì)算創(chuàng)面愈合率的二值化灰度圖程序,根據(jù)被測(cè)物所對(duì)應(yīng)的像素?cái)?shù)以及每個(gè)像素的實(shí)際面積,利用圖像技術(shù)分別測(cè)量參考物和被測(cè)傷口像素?cái)?shù),得出像素比,即面積比率,即得出殘余創(chuàng)面愈合率。方差分

11、析表明各組間有顯著性差異(F=18.201,P=0.000),用LSD法進(jìn)行組間兩兩比較,結(jié)果顯示D組和其它各組間差異性均顯著(P<0.01)；其它各組間比較,差異不明顯,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),D組較其它各組療效好。
　　 4.觀察創(chuàng)面愈合組織學(xué)變化
　　 4.1光鏡觀察組織HE染色
　　 術(shù)后第7 d,A、E、F組可見:巨噬細(xì)胞(創(chuàng)面愈合的“調(diào)控細(xì)胞”)主要出現(xiàn)在周圍正常組織,于創(chuàng)面愈

12、合部位出現(xiàn)較晚；到第10 d可見數(shù)量較多染色較深的成纖維細(xì)胞,毛細(xì)血管增生活躍；于第14～18 d可見大量的成纖維細(xì)胞,血管數(shù)量較多,管壁增厚,內(nèi)皮細(xì)胞增生；28 d時(shí)仍可見大量成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管,管壁繼續(xù)增厚,內(nèi)皮細(xì)胞繼續(xù)增生。術(shù)后從第3 d開始,B、C、D組可見:毛細(xì)血管長(zhǎng)入炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的肉芽組織,纖維母細(xì)胞散在分布于毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)之間；于第7 d,上皮樣郎格漢斯細(xì)胞以阿米巴樣運(yùn)動(dòng)游走于周圍正常組織和創(chuàng)面內(nèi)部,吞噬炎癥介質(zhì),傷口軟骨

13、細(xì)胞無(wú)壞死；3～18 d實(shí)驗(yàn)組肉芽組織較對(duì)照組生長(zhǎng)豐富且干凈,且無(wú)焦痂形成,上皮化過(guò)程較對(duì)照組早且明顯；28 d時(shí)有部分血管數(shù)量減少,甚至閉塞。A組的炎性細(xì)胞的數(shù)量及毛細(xì)血管的數(shù)量少于實(shí)驗(yàn)(B、D)組,跟C組差不多,術(shù)后第10 d可見數(shù)量較多的染色較深的成纖維細(xì)胞,毛細(xì)血管增生活躍。A組的炎性細(xì)胞及毛細(xì)血管的數(shù)量較E、F組稍多。
　　 4.2光鏡觀察組織Masson染色
　　 術(shù)后第7～10 d,B、C、D組創(chuàng)面修復(fù)區(qū)域

14、的膠原纖維較細(xì)小,排列較整齊；而A、E、F組膠原纖維相對(duì)較粗大,A組膠原纖維是粗細(xì)混合,排列稍紊亂,E、F組多數(shù)情況下創(chuàng)區(qū)粗膠原纖維較多。6組術(shù)后第14 d膠原染色增強(qiáng),至第18～28 d,均表現(xiàn)為粗大的排列紊亂的膠原纖維,鏡下觀察并無(wú)明顯區(qū)別。
　　 4.3光鏡觀察組織免疫組化(S-P法)
　　 術(shù)后第7 d,兔耳的腹、背部正常組織大、中、小血管處都有α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的特異性褐色表達(dá),兔耳各組正常組織陽(yáng)

15、性表達(dá)基本差不多。但在創(chuàng)面愈合部位存在較大區(qū)別,由于B、C、D組肉芽組織和新生血管生長(zhǎng)豐富,故陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度為:D組>B組>C組>A組>E組>F組。術(shù)后7 d,E、F組肉芽組織生成少,新生血管明顯要比實(shí)驗(yàn)組少。第3～18 d,褐色陽(yáng)性表達(dá)逐漸加深,于血管豐富處最明顯。
　　 5.氯胺T法測(cè)定組織的Hpr含量
　　 應(yīng)用改進(jìn)的氯胺T法測(cè)定組織中的Hpr含量,對(duì)數(shù)據(jù)行方差分析后結(jié)果顯示:術(shù)后3～28 d,C組與F組,D組與其它

16、各組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義:P≤0.05；LSD檢驗(yàn):于創(chuàng)傷愈合期(3～18 d),D組Hpr含量高于A、B、C、E、F組,即D組可以促使創(chuàng)面在愈合早期產(chǎn)生最多的膠原纖維。
　　 結(jié)論：
　　 1)本實(shí)驗(yàn)兔耳腹面的全層皮膚缺損后,可以產(chǎn)生與人組織學(xué)結(jié)構(gòu)類似的創(chuàng)面愈合過(guò)程,并且可以產(chǎn)生與人類相似的增生性瘢痕,進(jìn)一步驗(yàn)證了兔耳創(chuàng)面愈合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的科學(xué)性。
　　 2)采用國(guó)際公認(rèn)的MATLAB圖形處理軟件計(jì)算殘余創(chuàng)面