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文檔簡介
1、研究背景: 肺癌是嚴重危害人類生命和健康的常見疾病,目前國內外肺癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢。由于大多數肺癌患者臨床確診時已屬晚期,其中50%以上患者不能手術,而絕大部分肺癌患者(占肺癌的75%~80%,包括鱗癌、腺癌等)對現行放療和化療又不夠敏感,盡管已經聯合應用手術、放療、化療、生物治療等各種手段,但其預后改善并不明顯,深入研究肺癌分子生物學特征對肺癌的早期診斷、治療及改善預后具有重要意義。因此肺癌的治療成為臨床治療一大
2、難題,目前基因治療和化療耐藥的研究已成為肺癌的熱門課題。 NPRL2是一種最新發(fā)現的抑癌基因,目前國外少數專家的研究發(fā)現:其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用,特別是該基因的表達缺失導致了腫瘤細胞對順鉑的耐藥發(fā)生的特點,從而讓我們有理由相信:抑癌基因NPRL2的轉染與導入必將抑制腫瘤細胞增值、誘導凋亡及逆轉順鉑類的耐藥從而使NSCLC的治療可能進入一個嶄新的境界。 我們率先對NPRL2基因進行了臨床研究,利用免疫組化技術對我
3、國的非小細胞肺癌患者進行回顧性研究,發(fā)現該基因在NSCLC的病理組織中和多種肺癌細胞株上具有較高的缺失率,從而給我們的下一步研究工作奠定了基礎。 本研究試圖利用分子生物學和細胞生物學途徑,構建NPRL2基因載體,建立穩(wěn)定高表達NPRL2蛋白的肺癌細胞株,利用質粒構建-成功轉染-穩(wěn)定培養(yǎng)的細胞株來研究轉染NPRL2基因對肺癌細胞生長抑制及其作用機制。我們將利用耐順鉑人肺腺癌細胞株(A549/CDDP)進行體外的實驗研究:NPRL2
4、基因轉染可以逆轉A549/CDDP細胞株中NPRL2基因缺失表達,并能抑制細胞增殖、誘導其凋亡、逆轉順鉑類的耐藥,從而明顯抑制A549/CDDP細胞株的生長。為進一步進行肺癌基因治療的臨床前期研究提供了理論依據和實驗基礎。 第一章 NPRL2在非小細胞肺癌組織中的表達及臨床意義 目的:檢測NPRL2蛋白在非小細胞肺癌(NSCLC)中的表達,探討其臨床意義。 方法:應用免疫組織化學方法檢測80例非小細胞肺癌組織及1
5、3例正常肺組織中NPRL2蛋白的表達,分析其表達和臨床病理以及術后隨訪資料的相關性。Cox多因素分析肺癌臨床病理特征指標及NPRL2表達對NSCLC預后的影響。 結果:肺癌中NPRL2蛋白陽性表達35例(43.8%),正常肺組織中陽性表達12例(92.35%),兩者差異顯著(P<0.05)。肺鱗癌中陽性表達14例(33.33%),肺腺癌中陽性表達21例(55.26%),二者差異顯著(P<0.05);NPRL2蛋白在Ⅰ期陽性表達率
6、為69.24%(9/13);Ⅱ期為46.15%(18/39),ⅢA期為45.32%(26/47),NPRL2蛋白在非小細胞肺癌中隨著TNM分期的增加表達增強(P<0.05)。NPRL2蛋白在有淋巴結轉移的NSCLC(N1-2)中陽性表達率為27.28%(9/33),在無淋巴結轉移的NSCLC(N0)中陽性表達率為45.32%(26/47),差異顯著(P<0.05)。NPRL2蛋白表達缺失與年齡、性別、吸煙等因素無關。NPRL2蛋白陽性表
7、達組的病人無瘤生存時間顯著高于陰性組(p=0.026)。COX多因素分析結果顯示UICC分期、NPRL2表達和有無復發(fā)或轉移3個因素對生存率的影響有統(tǒng)計學意義。 結論:新抑癌基因NPRL2缺失在肺癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉移中可能起重要作用;NPRL2可能成為預測肺癌預后的新的腫瘤標志物。 第二章NPRL2基因轉染對肺癌A549/CDDP細胞腫瘤生物學行為的影響 目的:探討NPRL2基因轉染對肺癌細胞株A549/CD
8、DP腫瘤生物學行為的影響。 方法:利用基因重組技術構建重組質粒pcDNA3.1-NPRL2,脂質體life2000介導轉染體外培養(yǎng)的肺癌細胞株A549/CDDP,G418篩選獲得穩(wěn)定表達NPRL2的細胞株,MTT方法、劃痕愈合實驗和侵襲小室實驗檢測轉染前后A549/CDDP的腫瘤生物學行為。 結果:A549/CDDP細胞在轉染NPRL2基因后,克隆形成數減少,克隆體積較小,數目且排列較散,克隆形成率為12.6%;而轉染空
9、白質粒組克隆形成數較多,克隆體積較大,數目且排列緊密,克隆形成率分別為19.5%,兩者差異有顯著性(P<0.05)。表明NPRL2轉染A549/CDDP細胞后的增殖能力明顯低于轉染空質粒組和未轉染組細胞;A549/CDDP細胞轉染NPRL2后遷移細胞數為14.09±4.23個,顯著低于pcDNA3.1組34.18±9.77個,A549/CDDP組36.14±8.50個(P<0.05)。表明NPRL2轉染A549/CDDP細胞后顯著降低其
10、遷移力;A549/CDDP細胞轉染NPRL2后穿透matrigel的細胞數為74.09±4.48個,顯著低于pcDNA3.1組124.18±6.43個,A549/CDDP組120.14±7.25個(P<0.05)。表明NPRL2轉染A549/CDDP細胞后顯著降低其侵襲力。 結論:抑癌基因NPRL2的轉染可以抑制A549/CDDP細胞的增殖和侵襲運動。 第三章 NPRL2基因轉染誘導A549/CDDP細胞凋亡、逆轉其耐藥
11、性的研究 目的:探討新抑癌基因NPRL2在逆轉A549/CDDP耐藥性和誘導細胞凋亡的作用和機制。 方法:用0、10、40、160、320umol/mL濃度梯度的CDDP處理穩(wěn)定表達NPRL2的A549/CDDP細胞后,MTT檢測細胞增殖、檢測A549細胞和A549/CDDP細胞對順鉑的耐藥指數;流式細胞術檢測細胞周期變化;激酶法檢測NPRL2轉染對A549/CDDP細胞Caspase-3活性的影響,細胞免疫組化檢測Bl
12、c-2、Bax、P53和LRP蛋白的表達。 結果:pcDNA3.1-NPRL2組細胞死亡率隨順鉑濃度的增加而顯著增加與pcDNA3.1組、A549/CDDP組的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而pcDNA3.1組、A549/CDDP組間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。提示NPRL2的轉染可增強的A549/CDDP細胞對順鉑的敏感性。pcDNA3.1-NPRL2轉染組對順鉑的半數抑制濃度IC50為156.91±3.02/μ
13、mol/L,對順鉑的耐藥指數為7.62。對照組中轉染pcDNA3.1和A549/CDDP對順鉑的半數抑制濃度IC50為226.53±2.31和226.71±0.01/μmol/L,對順鉑的耐藥指數為11.17和11.39,比較差異有顯著性(P<0.05)。提示NPRL2轉染可以逆轉A549/CDDP細胞的耐藥性。且pcDNA3.1-NPRL2對肺腺癌A549/CDDP細胞存活率的抑制呈現出時間依賴性,與對照組比較差異有顯著性(P<0.0
14、5);在穩(wěn)定轉染NPRL2基因后A549/CDDP細胞生長緩慢,G0-G1期增多,與對照組比較差異有顯著性(P<0.05);pcDNA3.1-NPRL2轉染組在不同時間點均可使得A549/CDDP細胞Caspase-3活性增高,以48h最為顯著,其相對活性為1.1298±0.2502,與對照組比較差異有顯著性(P<0.05);NPRL2高表達明顯下調LRP蛋白和bcl-2蛋白,上調bax蛋白表達,與對照組比較差異有顯著性(P<0.05)
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