RNAi敲除SMAC基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞生長及順鉑耐藥性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分：
　　 目的：構(gòu)建針對目的基因SMAC的RNAi 質(zhì)粒載體，并在篩選出有效干擾靶點(diǎn)后進(jìn)行慢病毒包裝及細(xì)胞感染穩(wěn)定株的制備。
　　 材料和方法：
　　 1、針對目的基因靶基因序列，利用公用網(wǎng)站按照RNA 干擾序列設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)多個(gè)RNA 干擾靶點(diǎn)序列，根據(jù)設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行評估測定，選擇最佳的動力學(xué)參數(shù)靶點(diǎn)進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)流程；由吉凱基因公司合成含干擾序列的雙鏈DNAoligo，其兩端含酶切位點(diǎn)粘端，直接連入酶切后

2、的RNA 干擾載體上。將連接好后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備好的細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞，對長出的克隆進(jìn)行PCR鑒定，在進(jìn)行測序?qū)Ρ群?，比對正確的克隆即為構(gòu)建成功的目的質(zhì)粒。
　　 2、為了確定復(fù)合載體是否轉(zhuǎn)染到人肺癌細(xì)胞中，在熒光顯微鏡下觀察感染Smac基因-RNAi-慢病毒載體后72 小時(shí)A549細(xì)胞中報(bào)告基因GFP的表達(dá)。RT-PCR和Western 印跡分析轉(zhuǎn)染Smac基因-RNAi-慢病毒載體前后，Smac在mRNA和蛋白水平的沉默效果。

3、r>　　 3、將編碼慢病毒顆粒的重組病毒顆粒及其兩種輔助包裝載體質(zhì)粒分別進(jìn)行高純度無內(nèi)毒素抽提，按lipofectamine2000 試劑盒使用說明進(jìn)行共轉(zhuǎn)染T293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后按說明書進(jìn)行培養(yǎng)，之后收集、濃縮富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，在T293細(xì)胞中測定并標(biāo)定病毒滴度。
　　 結(jié)果：
　　 1、含有vshRNA 片段的psc-1 克隆為所成功構(gòu)建的含有siRNA 靶序列載體。
　　 2、A549細(xì)胞在轉(zhuǎn)染了

4、上述慢病毒72 小時(shí)后，超過80％的A549細(xì)胞表達(dá)了marker基因GFP，表明該轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的高效和穩(wěn)定、SMAC基因在敲除后在mRNA（抑制效率約為70％，P 值＜0.01）和蛋白水平都較敲除前有顯著意義于，表明RNAi有效靶點(diǎn)篩選成功。
　　 3、工具細(xì)胞與病毒載體進(jìn)成功行包裝并制備細(xì)胞感染的穩(wěn)定株。
　　 結(jié)論：SMAC RNAi 干擾質(zhì)粒載體成功構(gòu)建并篩選出RNAi 有效靶點(diǎn)，對其進(jìn)行慢病毒包裝與滴度測定后制備了

5、細(xì)胞感染的穩(wěn)定株，這為后續(xù)對SMAC基因進(jìn)行功能研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分：
　　 目的：針對目的基因SMAC 構(gòu)建過表達(dá)的慢病毒載體，為后續(xù)基因功能研究準(zhǔn)備載體工具。
　　 材料和方法：
　　 1、從含目的基因的質(zhì)?；騝DNA文庫中，用PCR釣取目的基因。由吉凱基因公司進(jìn)行目的基因的引物合成與鑒定，對目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、酶切，表達(dá)載體酶切、純化，定向克隆連接重組后與感受態(tài)細(xì)胞共轉(zhuǎn)染，PCR鑒定

6、轉(zhuǎn)化子，送invitrogen 公司進(jìn)行陽性克隆測序和比對分析，比對正確的克隆即為構(gòu)建成功目的質(zhì)粒。
　　 2、在目的細(xì)胞A549中，通過轉(zhuǎn)染含有Smac 全長編碼序列的pGC-FU 載體來實(shí)現(xiàn)Smac 高表達(dá)，轉(zhuǎn)染pGC-FU 載體的siRNA在C-末端含有marker基因GFP，通過western blot 觀察轉(zhuǎn)染前后Smac 蛋白水平的變化對過表達(dá)慢病毒載體的效果進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 3、按lipofectamine

7、 2000 使用說明進(jìn)行共轉(zhuǎn)染T293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后按說明書進(jìn)行培養(yǎng)并進(jìn)行收集、濃縮病毒液并進(jìn)行滴度的測定。
　　 結(jié)果：含有Smac 全長編碼序列的pGC-FU 載體高表達(dá)目的基因SMAC，并在蛋白水平得到驗(yàn)證。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建目的基因SMAC 過表達(dá)慢病毒載體，為后續(xù)SMAC基因進(jìn)行功能研究提供了可靠工具。
　　 第三部分：
　　 目的：探討慢病毒介導(dǎo)RNAi 敲除Smac基因前后對肺癌細(xì)胞生長及

8、順鉑耐藥性的影響，并且通過轉(zhuǎn)染含有Smac 全長編碼序列的pOE 載體來實(shí)現(xiàn)Smac的高表達(dá)，以來進(jìn)一步驗(yàn)證Smac 對肺癌細(xì)胞生長和對順鉑耐藥性的影響。從正反兩方面來相互驗(yàn)證，以來為進(jìn)一步研究Smac在肺癌細(xì)胞生長及對順鉑耐藥性的可能機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 材料和方法：
　　 1、用慢病毒介導(dǎo)RNAi 敲除Smac基因，用MTT，細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)，Annexin V-PI 雙染流式細(xì)胞儀檢測凋亡等手段來檢測A549和95

9、D細(xì)胞敲除Smac基因前后增殖能的力變化。
　　 2、用MTT、Annexin V-PI 雙染流式細(xì)胞儀檢測順鉑干預(yù)前后和Smac基因敲除前后細(xì)胞生長情況和凋亡比率的變化來研究其對順鉑耐藥的影響。
　　 3、用轉(zhuǎn)染含有Smac 全長編碼序列的pOE 載體來實(shí)現(xiàn)Smac高表達(dá)的A549細(xì)胞系，用MTT 實(shí)驗(yàn)、Brdu 增殖試驗(yàn)來檢測順鉑干預(yù)前后細(xì)胞生長能力的變化來進(jìn)一步驗(yàn)證Smac基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞生長及順鉑耐藥性的影響。

10、r>　　 結(jié)果：
　　 1、MTT分析法和克隆形成試驗(yàn)觀察S mac基因敲除后對肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和95D 生長的影響，與pNC-轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，pKD-轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖顯著增加，說明Smac基因敲除后促進(jìn)人肺癌細(xì)胞生長。
　　 2、在克隆形成試驗(yàn)中，pKD-轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞克隆量和大小與pNC-轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比有顯著增加，提示Smac基因敲除促進(jìn)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的集落形成能力。
　　 3、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測也表明Sma

11、c基因敲除可抑制順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞調(diào)亡。在A549和95D 兩種細(xì)胞系中，Smac下調(diào)時(shí)，早期和晚期調(diào)亡細(xì)胞的比例(LR和UR）大大下降；細(xì)胞存活率則顯著增加。
　　 4、pOE-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系A(chǔ)549 Smac 蛋白表達(dá)明顯增加，證明了慢病毒介導(dǎo)的Smac 高表達(dá)。與Smac基因敲除相反，Smac 高表達(dá)顯著抑制A549細(xì)胞生長，并且增強(qiáng)其對順鉑的敏感性，從另一方面證明了Smac在肺癌細(xì)胞生長和藥物耐藥中的重要作用。