Bad蛋白逆轉(zhuǎn)肺癌雷帕霉素耐藥性機(jī)制的研究.pdf

1、雷帕霉素（Rapamycin）作為雷帕霉素靶體蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）抑制劑可以有效抑制mTOR通路活性并已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床，然而研究及臨床數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤中雷帕霉素可通過負(fù)反饋途徑激活PI3K/AKT或MAPK/ERK信號通路，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對雷帕霉素的耐藥性。然而對于PI3K/AKT或MAPK/ERK通路被雷帕霉素激活后，其下游的關(guān)鍵效應(yīng)蛋白目前尚不清楚。通過預(yù)實驗，我們發(fā)

2、現(xiàn)人肺癌細(xì)胞經(jīng)雷帕霉素處理后，Bad磷酸化水平提高，同時激活的ERK1/2和AKT水平升高，并且，在雷帕霉素抗性細(xì)胞株中Bad的磷酸化水平明顯高于其敏感細(xì)胞株。因此，我們推測Bad磷酸化可能參與肺癌細(xì)胞對雷帕霉素的耐藥性，并通過以下實驗來證實這一觀點：
　?、俪醪阶C實雷帕霉素誘導(dǎo)的Bad磷酸化與腫瘤細(xì)胞對雷帕霉素耐藥性之間的關(guān)系；
　?、谔接懤着撩顾卣T導(dǎo)的Bad磷酸化可能導(dǎo)致細(xì)胞耐藥的相關(guān)機(jī)制；
　?、圩C實雷帕霉素負(fù)反

3、饋激活的Bad磷酸化激酶對Bad的調(diào)控作用，并探討阻斷該激酶是否可以提高或恢復(fù)細(xì)胞的敏感性；
　?、荏w內(nèi)實驗探討通過阻斷Bad的上游激酶抑制Bad的磷酸化是否可以改善雷帕霉素對腫瘤的療效。
　　主要的研究結(jié)果如下：
　?、偻ㄟ^免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)，人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H460和H157經(jīng)雷帕霉素處理后，BadS112/S136位點的磷酸化水平明顯增高，同時發(fā)現(xiàn)ERK1/2和AKT作為雷帕霉素負(fù)反饋激活的信號通路和Bad的上

4、游磷酸化激酶表達(dá)上調(diào)，表明Bad的磷酸化可能與肺癌細(xì)胞對雷帕霉素的耐藥性相關(guān)。
　?、谕ㄟ^SRB和平板克隆形成實驗比較A549雷帕霉素敏感和抗性細(xì)胞株，確認(rèn)其對于雷帕霉素的敏感性存在明顯差異，然后比較其蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)抗性細(xì)胞株中的BadS112/S136位點和上游激酶ERK1/2、AKT的磷酸化水平明顯高于敏感細(xì)胞株，進(jìn)一步證實Bad磷酸化可能參與肺癌細(xì)胞對雷帕霉素的耐藥性。
　　③在H460、A549敏感和抗性細(xì)胞系中分別

5、過表達(dá)Bad-WT或Bad-S112A/S136A(Bad-AA)，發(fā)現(xiàn)Bad-AA實驗組（即Bad不能被誘導(dǎo)發(fā)生磷酸化），經(jīng)雷帕霉素處理后，細(xì)胞的生長率與Vector對照組相比明顯降低。同時發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Bad-AA時，可以逆轉(zhuǎn)抗性細(xì)胞對雷帕霉素的耐藥性，表明Bad磷酸化在肺癌細(xì)胞對雷帕霉素的耐藥性中發(fā)揮重要的作用。
　　④首先通過免疫印跡和免疫細(xì)胞熒光實驗證實雷帕霉素可以誘導(dǎo)Bad由線粒體轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)中，然后通過免疫共沉淀實驗證實

6、經(jīng)雷帕霉素處理后，Bad與Bcl-XL的結(jié)合減少，與14-3-3蛋白的結(jié)合增加。同時發(fā)現(xiàn)雷帕霉素可以誘導(dǎo)濃度依賴性的Bad泛素化降解，從而縮短Bad的半衰期，使Bad的穩(wěn)定性下降。該結(jié)果初步闡明了雷帕霉素可誘導(dǎo)Bad失活的分子機(jī)制。
　?、萃ㄟ^免疫印跡和SRB實驗證實阻斷Bad的上游激酶可以有效阻斷BadS112/S136位點的磷酸化，有效提高雷帕霉素對細(xì)胞的生長抑制作用，并可以逆轉(zhuǎn)A549抗性細(xì)胞對雷帕霉素的耐藥性。然后通過流式

7、細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)阻斷ERK1/2和AKT激酶的活性，可以明顯協(xié)同雷帕霉素阻斷細(xì)胞周期的進(jìn)程和誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。進(jìn)而明確了雷帕霉素負(fù)反饋激活的ERK1/2和AKT信號通路，通過誘導(dǎo)下游效應(yīng)蛋白Bad的磷酸化而導(dǎo)致細(xì)胞的耐藥性。
　　⑥構(gòu)建裸鼠荷瘤模型，體內(nèi)實驗證實用PD98059和AktshRNA阻斷ERK1/2和AKT通路可以有效改善雷帕霉素的抑瘤作用，同時免疫組織化學(xué)染色檢測不同處理組BadS112/S136/S

8、155磷酸化位點的表達(dá)情況，最后用TUNEL法檢測腫瘤組織中細(xì)胞的凋亡，進(jìn)一步闡明阻斷ERK1/2和AKT通路可以抑制Bad的磷酸化，從而有效改善雷帕霉素對肺癌的治療效果。
　　結(jié)論：
　　通過本課題的研究證實，雷帕霉素可促進(jìn)Bad由線粒體轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)中，減少Bad與Bcl-XL的結(jié)合，增加Bad與14-3-3蛋白的結(jié)合，從而失去其促凋亡活性。同時雷帕霉素誘導(dǎo)的Bad磷酸化促進(jìn)其蛋白的泛素化降解，使Bad的半衰期明顯縮短，從

9、而降低Bad的穩(wěn)定性。另外我們通過體內(nèi)體外實驗證實，通過阻斷Bad的上游激酶ERK1/2和AKT來抑制Bad磷酸化可以提高肺癌對雷帕霉素的敏感性，并可以逆轉(zhuǎn)抗性細(xì)胞的抗藥性，從而有效改善雷帕霉素的治療效果。我們的研究揭示了Bad在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對雷帕霉素的耐藥性中發(fā)揮重要的作用，初步闡明了雷帕霉素誘導(dǎo)Bad磷酸化從而導(dǎo)致肺癌細(xì)胞耐藥的分子機(jī)制，明確了雷帕霉素通過負(fù)反饋激活ERK1/2和AKT從而誘導(dǎo)Bad的磷酸化的調(diào)控機(jī)制，為改善雷帕