小地老虎性信息素合成激活肽受體(PBANR)的克隆、表達及RNAi研究.pdf

1、小地老虎 Agrotis ipsilon是一種破壞力很強的遷飛性鱗翅目害蟲，危害世界范圍內(nèi)的多種作物。性信息素合成激活肽受體（PBANR），調(diào)節(jié)多種鱗翅目昆蟲性信息素的合成。能夠與調(diào)控性信息素合成中扮演重要角色的GPCRs結(jié)合。在鱗翅目成蟲中，交配能夠引起雌蟲短時間終止性信息素的產(chǎn)生。本文通過RACE-PCR方法，從小地老虎雌蟲性腺中克隆獲得小地老虎PBANR全長基因，命名為Aips-PBANR，該基因由3539個堿基組成。蛋白序列比對

2、表明，Aips-PBANR與鱗翅目其他昆蟲的PBANR具有較高的序列一致性。利用RT-PCR方法，從小地老虎雌蟲性腺和雄蟲生殖器中均檢測到 Aips-PBANR基因的表達。qRT-PCR該基因在成蟲不同組織和日齡的表達特征進行研究。結(jié)果表明，Aips-PBANR在雌蟲性腺中的表達量最高，在雄蟲的生殖器中也檢測到較低的表達；羽化后第四天上午2:00基因表達量最高；另外，qRT-PCR結(jié)果表明，交配能夠明顯抑制 Aips-PBANR基因的表

3、達，因此進一步證明交配能夠抑制昆蟲性信息素的產(chǎn)生。
　　RNA干擾技術(shù)（RNAi）作為害蟲防治的新方法具有很大的應用潛力。然而，在不同昆蟲之間RNAi干擾效率存在很大差異。其中，鱗翅目是最難應用RNAi技術(shù)的昆蟲。本文以小地老虎 Aips-PBANR基因為研究對象，通過分別注射 dsRNA和 siRNA的方法干擾Aips-PBANR基因在雌蟲中的表達。對8~9日齡雌蟲腹部分別注射20μl siRNA、dsRNA、dsGFP和水，7

4、2小時后通過qRT-PCR方法檢測沉默效率。結(jié)果表明，注射siRNA的試驗組， PBANR基因mRNA表達量下調(diào)90％以上，注射dsRNA的試驗組下調(diào)56%，下調(diào)水平均顯著高于注射dsGFP、水以及未注射的對照組。
　　小地老虎在時間和空間維度上具有令人驚訝的個體生長，種群存活以及繁殖能力。幼蟲的爆發(fā)與遷飛成蟲經(jīng)歷的溫度密切相關。然而與種群爆發(fā)及遷飛相關的機制目前尚不清楚。本文還在室內(nèi)研究了不同溫度范圍（16–36℃）對小地老虎交

5、配、產(chǎn)卵以及壽命的影響。試驗結(jié)果表明，在24–28℃范圍內(nèi)，成蟲的交配率與交配頻率最高，超出該范圍交配率與交配頻率降低；高溫條件下，成蟲夜間交配起始時間延遲，隨著溫度增加，交配持續(xù)時間降低，同時，產(chǎn)卵前期和產(chǎn)卵期逐漸下降；高峰日和繁殖力最高，并隨著溫度降低呈下降趨勢。另外，溫度與成蟲壽命關系表明，成蟲壽命與溫度呈負相關；低溫條件下雄蟲的壽命高于雌蟲；32–36℃，雌蟲壽命高于雄蟲。因此，認為24–28℃是小地老虎繁殖產(chǎn)卵的最佳溫度范圍，

6、幼蟲危害或爆發(fā)可能發(fā)生在溫度范圍在24–28℃的區(qū)域，這將為預測種群爆發(fā)的區(qū)域范圍提供重要依據(jù)。
　　本文首次從小地老虎雌蟲性腺克隆獲得了 Aips-PBANR基因。定量研究了該基因轉(zhuǎn)錄本在小地老虎不同組織、日齡及交配前后的表達變化。通過雌蟲腹部注射siRNA和dsRNA的方法對 Aips-PBANR基因進行沉默。這些研究結(jié)果為幫助干擾生殖功能作為害蟲管理方法以及理解神經(jīng)肽受體多樣化功能提供可靠的基礎。另外，明確不同溫度對小地老虎