蟲草素合成相關(guān)酶基因克隆與表達(dá).pdf

1、蟲草素具有抗炎、抗腫瘤、抑制微生物生長等明顯的藥理活性，現(xiàn)已制作出多種以蟲草素為主要藥性成分的成藥，其臨床應(yīng)用前景非常廣闊，但由于其在蛹蟲草中含量很低，且人工合成困難，因而蟲草素價(jià)格不斷上揚(yáng)，嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用。因此研究通過生物學(xué)方法，使菌株自身蟲草素表達(dá)量提高，很大程度上將解決限制蟲草素應(yīng)用的關(guān)鍵問題。
　　本研究利用蝙蝠蛾擬青霉菌（Paecilomyces hepiali）作為實(shí)驗(yàn)菌種。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)的方法，對(duì)蟲草素

2、的代謝途徑進(jìn)行了探究。在已完成蝙蝠蛾擬青霉菌的全基因組測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組信息初步分析的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步分析不同轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因，并將差異基因進(jìn)行聚類分析。篩選得到140多個(gè)目標(biāo)基因，這些基因都是參與核苷酸通路代謝的上調(diào)表達(dá)基因。隨后，結(jié)合STITCH化合物互作數(shù)據(jù)庫，在目標(biāo)基因中選定了AMI、IMP、GMP這三個(gè)基因，作為后續(xù)研究中的擬定關(guān)鍵酶基因。分別設(shè)計(jì)各關(guān)鍵酶基因的特異性擴(kuò)增引物，通過PCR擴(kuò)增，對(duì)關(guān)鍵酶基因進(jìn)行克隆，隨后將擴(kuò)增所得片段

3、整合至pMD18-T質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，回收測(cè)序結(jié)果與基因序列匹配的擴(kuò)增產(chǎn)物。接著，通過In-fusion重組技術(shù)，將目標(biāo)基因分別整合到含有強(qiáng)啟動(dòng)子35S的質(zhì)粒pCambia1300中。隨后，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入蝙蝠蛾擬青霉菌中。經(jīng)過多輪篩選，分別得到了AMI基因、IMP基因、GMP基因的可穩(wěn)定遺傳工程菌株，分別記為轉(zhuǎn)基因AMI組、轉(zhuǎn)基因IMP組以及轉(zhuǎn)基因GMP組。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，分別對(duì)三組工程菌中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量

4、進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因AMI組中，AMI基因表達(dá)量較陰性結(jié)果上調(diào)約2倍；轉(zhuǎn)基因IMP組中，IMP基因表達(dá)較陰性對(duì)照組提高并有極顯著性差異，上調(diào)達(dá)到近40倍；轉(zhuǎn)基因GMP組中，GMP基因表達(dá)較陰性對(duì)照組同樣明顯上調(diào)并有顯著性差異，上調(diào)約7倍。最后，利用液質(zhì)色譜聯(lián)用技術(shù)，測(cè)定轉(zhuǎn)基因菌種培養(yǎng)液中的蟲草素含量。結(jié)果表明在代謝較為旺盛的第九天，轉(zhuǎn)基因AMI組和轉(zhuǎn)基因IMP組的蟲草素含量較陰性對(duì)照組提高了2倍，而轉(zhuǎn)基因GMP組的蟲草素含量較陰