砂梨果實乙烯受體基因的克隆、表達調(diào)控及其RNAi載體的構(gòu)建.pdf

1、砂梨(Pyrus pyrifolia Nakai)原產(chǎn)于我國中部、南部和西部各省，適于在溫暖多雨地區(qū)栽培，是原產(chǎn)于我國的四個梨樹種之一，具有耐熱、抗旱、抗火疫病等優(yōu)良性狀。但其果實大多貯藏性差，如何提高果實耐貯性是解決砂梨產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵問題。冷藏和氣調(diào)貯藏是目前延長砂梨貯藏期的的主要技術(shù)手段，但這些技術(shù)在大多數(shù)砂梨品種上難以保證果實的長期貯藏，滿足不了市場的需求.培育耐貯藏的優(yōu)質(zhì)新品種，結(jié)合保鮮劑等采后技術(shù)手段是解決砂梨貯藏問題的關(guān)鍵.我

2、們以‘菊水’梨果實為材料，利用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆到PpETR3和PpERS2兩個乙烯受體基因cDNA全長，構(gòu)建它們的RNAi表達載體，并將PpETR3表達載體通過農(nóng)桿菌介導法進行番茄轉(zhuǎn)化，獲得了2個轉(zhuǎn)基因株系，為進一步驗證PpETR3乙烯受體在乙烯信號轉(zhuǎn)導途徑中的功能及培育耐貯藏的番茄新品種奠定基礎(chǔ)。同時研究外源乙烯和乙烯受體抑制劑1-MCP(1-甲基環(huán)丙稀)熏蒸對采后不同時期‘菊水’(‘kikusui’)果實的生理以及Pp

3、ETR3和PpERS2基因表達的影響.結(jié)合果實采后生理的變化，揭示PpETR3和PpERS2兩個受體在乙烯信號轉(zhuǎn)導過程中的功能。 1、為獲得符合果實基因克隆和表達研究需要的RNA，我們以‘菊水’梨果實為材料，通過兩種CTAB改良法提取不同后熟期的果皮和果肉的總RNA，研究果實不同后熟期對果皮和果肉總RNA提取的質(zhì)量和產(chǎn)量的影響，并針對不同梨果實成熟階段RNA提取的特點，對傳統(tǒng)的CTAB法進行改良，以較低的成本從果實中提取完整性好

4、、質(zhì)量高的總RNA.同時在近成熟的‘紅富士’葡萄、‘富士’蘋果和‘豐香’草莓等3種果實上進一步驗證，并通過RT-PCR驗證，所提取的總RNA可以滿足基因克隆和表達等分子生物學實驗的要求。 2、根據(jù)已報道其它植物果實乙烯受體基因的保守區(qū)域設(shè)計簡并引物，用RT-PCR和RACE的方法從‘菊水’梨果實中獲得兩個新的砂梨乙烯受體基因PpETR3和PpERS2的cDNA全長，分別為2707bp和2260bp，各有2223bp和1914bp

5、完整的開放閱讀框(ORF)，GenBank登錄號分別為EU021507和EU117197。PpETR3編碼741個氨基酸，其核苷酸和氨基酸序列與蘋果、梨、李和桃等4中果實乙烯受體家族中ETR1亞類基因相似性和同源性在90-98％。分子結(jié)構(gòu)預測：受體蛋白理論分子量為83.01kD，理論等電點為8.26.PpERS2編碼638個氨基酸，其核苷酸和氨基酸序列與蘋果、梨等果實乙烯受體家族ETR2亞類相似性和同源性為90-96％。分子結(jié)構(gòu)預測：受

6、體蛋白理論分子量為71.55kD，理論等電點為6.25。 3、用80μL-L-1外源乙烯和1.0μL-L-11-MCP熏蒸采后不同時期‘菊水’梨果實，在25±1℃貯藏溫度下，研究處理后果實后熟過程中品質(zhì)、生理指標的變化和乙烯受體基因PpETR3和PpERS2表達。結(jié)果顯示：在采收當天和呼吸躍變初期，外源乙烯處理能促進果實硬度和可溶性固形物含量的顯著地下降，降低活性氧清除酶(SOD、CAT和APX)的活性，提高呼吸速率和乙烯釋放速

7、率，促進果實后熟；1-MCP處理表現(xiàn)出與乙烯相反的效應(yīng)，且采收當天比呼吸躍變初期的作用效果更明顯。在呼吸躍變中期處理，外源乙烯和1-MCP作用效果均不明顯。研究發(fā)現(xiàn)，外源乙烯和1-MCP對果實后熟的影響因處理果實后熟期的不同而存在顯著差異，果實后熟程度越高，其處理的效果越不明顯.在采收當天處理的果實后熟過程中，對照果實PpETR3和PpERS2表達總體上隨著果實的后熟逐漸增強。1-MCP處理明顯提高果實采后初期PpETR3基因的表達，降

8、低果實采后中期PpERS2基因的表達，然而外源乙烯對果實采后初期PpERS2表達有明顯的促進作用，對果實整個后熟期間PpETR3表達沒有明顯地影響。 4、以‘菊水’梨近成熟果實為材料，提取總RNA。通過RT-PCR技術(shù)克隆砂梨乙烯受體基因PpETR3和PpERS2反義、正義基因片段，然后將反義、間隔區(qū)YYT-1(GenBank登錄號AY345165)和正義三基因片段串連，構(gòu)建雙鏈RNAi重組質(zhì)粒，經(jīng)鑒定測序正確后，作為外源基因單

9、元插入酶切后的植物雙元表達載體pYF7704質(zhì)粒中，分別構(gòu)建這2個乙烯受體基因雙鏈RNAi表達載體pYF0810和pYF0811，并轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細胞中。 5、為了研究乙烯受體PpETR3干擾基因在植物體中的表達特性，通過農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化番茄子葉，將侵染的493個外植體先經(jīng)MS+ZT1mg/L+IAA0.5mg/L+Km50mg/L+250mg/L Cef+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L(pH5.8)篩選培養(yǎng)基，