小地老虎幾丁質(zhì)代謝酶基因的克隆及分子特性研究.pdf

1、目前已分離出一些昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶，并且已將昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶基因?qū)氲街参镏幸栽鰪?qiáng)植物的抗蟲(chóng)性，及將幾丁質(zhì)酶嵌入到昆蟲(chóng)病原體內(nèi)，增強(qiáng)昆蟲(chóng)病原體對(duì)害蟲(chóng)的為害。本文從小地老虎體內(nèi)分離和表達(dá)了幾丁質(zhì)代謝相關(guān)酶基因，詳細(xì)了解其分子特性對(duì)研究和開(kāi)發(fā)幾丁質(zhì)代謝相關(guān)酶為基礎(chǔ)的殺蟲(chóng)劑是十分必要的。 ⑴從預(yù)蛹期小地老虎體內(nèi)分離出兩條幾丁質(zhì)酶基因cDNA序列，一條是全長(zhǎng)基因序列，另一條是包含5’端的基因片段。全長(zhǎng)的小地老虎幾丁質(zhì)酶基因cDNA序列長(zhǎng)度為282

2、3bp，包括1677個(gè)堿基的開(kāi)放讀碼框，編碼558個(gè)氨基酸，分子量為62.5kDa。5’端的幾丁質(zhì)酶基因cDNA序列片段長(zhǎng)度為1082bp，編碼360個(gè)氨基酸。由全長(zhǎng)幾丁質(zhì)酶基因推導(dǎo)的氨基酸序列包含兩個(gè)保守區(qū)域，一個(gè)是N-端的高度保守的幾丁質(zhì)催化區(qū)，另一個(gè)是C-端包括六個(gè)半胱氨酸的幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)。在催化區(qū)和幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)中間有一個(gè)被稱(chēng)為L(zhǎng)inker的富含脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和谷氨酸的區(qū)域(PEST富集區(qū))。預(yù)測(cè)其成熟期蛋白的N-端還含有一

3、個(gè)疏水性的信號(hào)肽。 ⑵從已發(fā)現(xiàn)昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶基因推導(dǎo)的氨基酸序列中的N-位和O-位糖基化的何點(diǎn)的確定，對(duì)于研究昆蟲(chóng)蛋白的分泌和維持其穩(wěn)定性是必要的。利用PROSCAN和NetOGlyc2.0軟件發(fā)現(xiàn)住小地老虎幾丁質(zhì)酶氨基酸序列中有2個(gè)N-位糖基化位點(diǎn)和20個(gè)O-位糖基化位點(diǎn)。 ⑶從預(yù)蛹期小地老虎體內(nèi)分離出兩條包含3’端的β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因的cDNA序列。其中一條的長(zhǎng)度為2267bp，包括1509個(gè)堿基的開(kāi)放讀碼框

4、，編碼503個(gè)氨基酸，分子量為57.6kDa。另一條的長(zhǎng)度為2278bp，包括1509個(gè)堿基的開(kāi)放讀碼框，編碼503個(gè)氨基酸，分子量為57.5kDa。兩條β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因推導(dǎo)的氦基酸序列都包含兩個(gè)保守區(qū)，一個(gè)是N-端的水解催化區(qū)，另一個(gè)是C-端的水解結(jié)合區(qū)。 ⑷利用PROSCAN和NetOGlyc2.0軟件發(fā)現(xiàn)在兩條小地老虎β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶氨基酸序列中都有3個(gè)N-何糖基化位點(diǎn)和1個(gè)O-何糖基化位點(diǎn)。從取食期小

5、地老虎體內(nèi)分離出一條幾丁質(zhì)合成酶基因cDNA序列，長(zhǎng)度為975bp，包括792個(gè)堿基的開(kāi)放讀碼框，編碼264個(gè)氨基酸，分子量為30.0kDa。利用BLAST搜尋出許多與小地老虎幾丁質(zhì)酶基因具有高同源性的昆蟲(chóng)基因。其推導(dǎo)的氨基酸序列與煙草天蛾相應(yīng)序列推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為80％，與棉鈴蟲(chóng)同源性為85％，與美國(guó)白蛾同源性為83％，與斜紋夜蛾同源性為89％。序列比對(duì)表明小地老虎幾丁質(zhì)酶基因與其他鱗翅目昆蟲(chóng)的幾丁質(zhì)酶基因顯示高同源性(75％以

6、上)。利用BLAST搜尋出與小地老虎β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因具有高同源性的昆蟲(chóng)基因。其推導(dǎo)的氨基酸序列與煙草大蛾相應(yīng)片段推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為73％，與草地貪夜蛾同源性為37％，與玉米螟同源性為74.4％。用BLAST搜尋出與小地老虎幾丁質(zhì)合成酶基因具有高同源性的昆蟲(chóng)基因。其推導(dǎo)的氨基酸序列與煙草大蛾相應(yīng)序列推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為79％，與甘監(jiān)夜蛾同源性為92％，與甜菜夜蛾同源性為89.4％。 ⑸克隆出的小地老虎幾丁質(zhì)代