糖原磷酸化酶腦型(PYGB)在肝細(xì)胞癌中的生物學(xué)功能及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　 肝癌(hepatocellular carcinoma)是世界第七大常見腫瘤，在癌癥相關(guān)死亡中排第三位;我國是世界上肝癌發(fā)病集中的國家，每年新發(fā)病例約占全球的45％。肝癌死亡率高，其診斷的金指標(biāo)AFP在肝癌中只有70％左右的陽性率，如果能找到特異的蛋白或基因，這將對研究肝癌發(fā)病機(jī)制、新的治療方法以及提高其早期診斷率具有重要的意義。
　　 糖原磷酸化酶（Glycogen phosphorylase，

2、GP）是糖原分解代謝的限速酶，糖原磷酸化酶腦型(Brain-type GP, PYGB或BGP)是其的一個亞型;PYGB主要在成人腦組織、胚肝組織和惡性腫瘤中表達(dá)，其功能一般認(rèn)為是在應(yīng)急狀態(tài)為機(jī)體提供能量。
　　 Sato K等研究表明PYGB在鼠Novikoff和Morris3924A肝癌細(xì)胞系中表達(dá)明顯增高，但在正常的肝臟和Morris hepatoma20不表達(dá)或表達(dá)極低。前期實驗發(fā)現(xiàn)PYGB在肝癌細(xì)胞系中表達(dá)升高，其表達(dá)

3、水平隨著腫瘤惡性程度的增加而增高，這是否提示PYGB具有促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展的功能，這方面的研究至今尚未見文獻(xiàn)報道。一般認(rèn)為PYGB功能是在人體應(yīng)急狀態(tài)時為機(jī)體提供能量，而眾所周知，由于腫瘤細(xì)胞增殖生長旺盛，腫瘤常常處于缺血缺氧的狀態(tài)。PYGB在肝細(xì)胞癌中表達(dá)的增加，這是否亦提示著在缺血缺氧的狀態(tài)下，肝癌細(xì)胞能夠得到更多的葡萄糖的供應(yīng)，使肝癌細(xì)胞在缺血缺氧的環(huán)境下能更好的存活。此外，我們前期實驗發(fā)現(xiàn)PYGB高表達(dá)組患者的無瘤生存期和生

4、存期均較低PYGB表達(dá)組低。因此，我們設(shè)計該課題，研究PYGB在肝細(xì)胞癌中的生物學(xué)行為及可能作用機(jī)制，這對研究肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制、提高早期診斷、預(yù)示患者的預(yù)后將有著重要的意義。
　　 實驗方法:
　　 一、肝癌細(xì)胞系中PYGB的表達(dá)。
　　 多種肝癌細(xì)胞系的培養(yǎng)，收取細(xì)胞裂解液，應(yīng)用western blot實驗檢測這些細(xì)胞系中PYGB表達(dá)水平;
　　 二、構(gòu)建PYGB過表達(dá)及干擾的質(zhì)?；蚵《?，建立穩(wěn)定的

5、細(xì)胞系。
　　 三、PYGB在肝細(xì)胞癌中生物學(xué)功能研究。
　　 (1)增殖實驗:CCK-8檢測所建的PYGB高低表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系在不同時間點的450nm的吸光度值;
　　 (2)抗凋亡檢測: TNFα和CHX孵育穩(wěn)定細(xì)胞系細(xì)胞，分別收集0h、6h、12h的細(xì)胞裂解液，采用Wesretn blot方法檢測PARP、caspase3等蛋白的表達(dá)情況;
　　 (3)克隆形成實驗:將穩(wěn)定細(xì)胞系細(xì)胞分別種至6孔板，

6、3000個/孔，37℃5％CO2孵箱培育，2-3周后觀察克隆形成的情況。
　　 (4)遷移實驗:A.劃痕試驗:顯微鏡下觀察PYGB高低表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系在0hr、12hr、24hr同一點劃痕間的距離。B.Transwell實驗:PYGB高低表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞無血清培養(yǎng)基重懸，取1×105個種至transwell小室，小室下為含10％血清的培養(yǎng)基，24hr后多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色后顯微鏡下觀察細(xì)胞的遷移情況。
　　 (5)裸鼠

7、皮下荷瘤實驗:將PYGB高低表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系的細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)，消化后重懸至每100ul培養(yǎng)基含0.5-1×107個細(xì)胞，裸鼠皮下注射100ul相應(yīng)的細(xì)胞，觀察腫瘤生長情況。IHC檢測瘤體PCNA、PYGB等的表達(dá)情況。
　　 (6)抗氧化應(yīng)急實驗:A.CCK-8檢測PYGB高低表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系予或不予不同試劑（如H2O2、無糖培養(yǎng)基等）刺激下在450nm時的吸光度值;B.Western blot實驗方法檢測PYGB高低表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)

8、胞系在無糖培養(yǎng)的條件下PARP、caspase3等凋亡相關(guān)的蛋白表達(dá)情況。
　　 四、PYGB在肝細(xì)胞癌中作用機(jī)制的探討。
　　 (1) ROS的檢測:用免疫探針D2FAA標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的ROS，在熒光顯微鏡下觀察ROS的數(shù)量。
　　 (2) caspase3活性的檢測:采用caspase3活性檢測的試劑盒檢測PYGB高低表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系中caspase3的活性。
　　 (3) hRIP1質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定;<

9、br>　　 (4)采用免疫共沉淀(IP)實驗方法檢測RIP1與PYGB間是否有相互作用。
　　 (5) Real-time PCR實驗方法檢測PYGB高低表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系中EMT相關(guān)的蛋白的變化。
　　 結(jié)果:
　　 (一) PYGB在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其作用。
　　 1、PYGB表達(dá)水平高低與肝癌細(xì)胞系的惡性程度密切相關(guān)，在低度惡性肝癌細(xì)胞系中，PYGB的表達(dá)水平較低，而在高度惡性的肝癌細(xì)胞系中，PY

10、GB表達(dá)水平明顯升高，即隨著肝癌惡性程度的增加PYGB的表達(dá)升高。
　　 2、構(gòu)建了PYGB過表達(dá)質(zhì)粒，建立Hep1-6和NIH3T3過表達(dá)PYGB的穩(wěn)定細(xì)胞系;構(gòu)建干擾PYGB的慢病毒，建立MHCC97H和MHCC97L干擾PYGB的穩(wěn)定細(xì)胞系。
　　 3、PYGB在肝細(xì)胞癌中的生物學(xué)行為研究:(1)細(xì)胞增殖實驗示過表達(dá)PYGB細(xì)胞增殖增快，干擾PYGB細(xì)胞增殖減慢;(2)抗凋亡實驗提示干擾PYGB，PARP剪切體增多

11、;(3)細(xì)胞遷移實驗提示過表達(dá)PYGB組腫瘤細(xì)胞遷移數(shù)目增多，而干擾PYGB組腫瘤細(xì)胞遷移數(shù)目減少。(4)克隆形成實驗提示過表達(dá)PYGB組腫瘤細(xì)胞形成克隆數(shù)目增多，克隆體積大，而干擾PYGB組腫瘤細(xì)胞形成克隆數(shù)目少、克隆體積小;(5)裸鼠皮下荷瘤實驗提示過表達(dá)PYGB組腫瘤體積較對照組增大，而干擾PYGB組腫瘤體積較對照組小;(6)抗氧化應(yīng)急實驗提示在H2O2或無糖等培養(yǎng)下，干擾PYGB細(xì)胞增殖減慢，PARP的剪切體增多。
　　

12、 4、NIH3T3細(xì)胞裸鼠皮下荷瘤實驗，過表達(dá)PYGB組表現(xiàn)為實體腫瘤生成，而對照組未見腫瘤生長。
　　 （二）PYGB在肝細(xì)胞癌中相關(guān)信號通路的研究。
　　 1、腫瘤細(xì)胞過表達(dá)PYGB組ROS產(chǎn)生較對照組少;H2O2刺激后，過表達(dá)PYGB組產(chǎn)生的ROS同樣較對照組少;
　　 2、caspase3活性檢測提示干擾PYGB后caspase3活性增高;予TNFα刺激后，干擾PYGB組的caspase3活性較對照組明顯

13、增高;
　　 3、構(gòu)建RIP1質(zhì)粒，免疫共沉淀實驗結(jié)果提示PYGB與RIP1之間存在相互作用;
　　 4、Real-time PCR結(jié)果提示肝細(xì)胞癌干擾PYGB后與EMT相關(guān)的蛋白E-cadherin較對照組升高，而Viminten、Desmin較對照組降低
　　 結(jié)論:
　　 1、在肝細(xì)胞癌中，PYGB的表達(dá)水平與肝癌細(xì)胞系的惡性程度相關(guān)，PYGB表達(dá)的上調(diào)，肝細(xì)胞癌的惡性程度增強(qiáng)。
　　 2、