擬南芥UDP-糖焦磷酸化酶(AtUSP)在糖核苷酸合成中的應用.pdf

1、糖類分子（包括單糖、寡糖和多糖）和糖綴合物廣泛存在于生物體內(nèi)，從低等的古細菌、細菌到高等的動物植物中，糖類化合物都發(fā)揮著不可替代的作用。結構上，糖類化合物復雜多變，使得糖類化合物蘊含豐富的信息功能，糖鏈的結構與功能研究已成為生物化學與生物醫(yī)藥學的研究熱點。但是天然分離的寡糖、多糖及糖綴合物中糖鏈結構不均一，增加了研究的困難，因此獲得結構均一的糖綴合物是研究它們的結構與功能的前提。
　　 化學法合成糖綴合物步驟復雜，產(chǎn)率低，酶法合

2、成結構均一的糖和糖綴合物成為重要手段，糖基轉移酶是酶法合成過程中應用最廣泛的工具酶。大多糖基轉移酶都以糖核苷酸作為糖基供體，然而糖核苷酸來源少且價格昂貴，制約了對糖綴合物的合成研究。
　　 本論文主要分為兩部分研究內(nèi)容，第一部分是一鍋法合成多種糖核苷酸（第二章），作為糖基轉移酶合成糖綴合物的糖基供體;第二部分研究了擬南芥來源的UDP-糖焦磷酸化酶AtUSP對不同核苷三磷酸的識別與利用情況，測定了AtUSP對UTP、dUTP和dT

3、TP的動力學參數(shù)，并小規(guī)模制備了dUDP-Glc和dTDP-Glc。
　　 在糖核苷酸的體外合成中，最為簡便的方法是利用補救合成途徑進行，補救合成途徑中，單糖分子首先需要進行1位的磷酸化，然后在焦磷酸化酶或尿苷轉移酶作用催化下合成糖核苷酸。第二章中我們從擬南芥總cDNA中克隆得到了UDP-糖焦磷酸化酶的基因(AtUSP)，對基因進行重組表達得到體外具有活性的AtUSP，結合本實驗室之前報道的來自肺炎鏈球菌的半乳糖激酶(SpGal

4、K)以及商品化的酵母菌焦磷酸酶(PPase)，以一鍋法的方式合成糖核苷酸o SpGalK和AtUSP都有較廣的底物適應性，對經(jīng)過化學修飾的天然單糖可能有一定的催化能力，一鍋法中，我們從天然單糖或結構經(jīng)過化學修飾的8種單糖分子出發(fā)，成功合成了5種相應的UDP-糖，其中UDP-Gal和UDP-4-N3-Gal產(chǎn)率較高分別達到95％和43％，UDP-Glc和UDP-Fuc產(chǎn)率較低都在30％以下，分別為23％和29％，UDP-2-N3-Gal產(chǎn)

5、率最低只在MS中檢測到了產(chǎn)物的生成。在化學反應中，疊氮基團屬于反應活性基團，一鍋法中我們以較高的產(chǎn)率獲得了4位疊氮化的UDP-Gal，為化學法衍生其它C-4位修飾的UDP-Gal提供了物質(zhì)基礎。與肺炎鏈球菌的UTP-Glc尿苷轉移酶(SpGalU)相比，AtUSP對C-4位修飾的Gal-1-P具有較大的容忍力，因此更適合于合成4位修飾的UDP-Gal衍生物。
　　 本文第三章主要進行了AtUSP對不同核苷三磷酸的識別與利用能力的

6、研究，測試的9種核苷三磷酸中，5種為嘧啶型核苷三磷酸(UTP、dUTP、dTTP、CTP和dCTP)，4種為嘌呤型核苷三磷酸（ATP、dm6ATP、GTP和dGTP），其中只有UTP、dUTP和dTTP可以被AtUSP催化，UTP利用率最高達到97％，dUTP和dTTP次之，分別為85％和84％，對其它5種核苷三磷酸均沒有反應，分析其原因可能與氫鍵的形成有關，UTP、dUTP和dTTP的嘧啶環(huán)上的C-4位上存在O原子，該處O原子可以與蛋

7、白形成氫鍵，促進酶與核苷三磷酸的結合，而CTP和dCTP該處的O原子被氨基基團代替無法與酶的相關氨基酸形成氫鍵，導致AtUSP無法識別，其它四種核苷三磷酸堿基部分不僅無法形成氫鍵而且結構龐大空間位阻大，影響了酶的識別;核苷三磷酸中核糖部分的C-2’位上的羥基雖然也可能參與氫鍵的形成，但并不影響酶的識別，只是稍微降低了酶對該核苷三磷酸的利用能力。動力學參數(shù)測定顯示AtUSP對UTP的Vmax、 kcat和Kcat/Km都遠大于dUTP和d