擬南芥UDP-糖焦磷酸化酶(AtUSP)在糖核苷酸合成中的應(yīng)用.pdf

1、糖類分子（包括單糖、寡糖和多糖）和糖綴合物廣泛存在于生物體內(nèi)，從低等的古細(xì)菌、細(xì)菌到高等的動物植物中，糖類化合物都發(fā)揮著不可替代的作用。結(jié)構(gòu)上，糖類化合物復(fù)雜多變，使得糖類化合物蘊含豐富的信息功能，糖鏈的結(jié)構(gòu)與功能研究已成為生物化學(xué)與生物醫(yī)藥學(xué)的研究熱點。但是天然分離的寡糖、多糖及糖綴合物中糖鏈結(jié)構(gòu)不均一，增加了研究的困難，因此獲得結(jié)構(gòu)均一的糖綴合物是研究它們的結(jié)構(gòu)與功能的前提。
　　 化學(xué)法合成糖綴合物步驟復(fù)雜，產(chǎn)率低，酶法合

2、成結(jié)構(gòu)均一的糖和糖綴合物成為重要手段，糖基轉(zhuǎn)移酶是酶法合成過程中應(yīng)用最廣泛的工具酶。大多糖基轉(zhuǎn)移酶都以糖核苷酸作為糖基供體，然而糖核苷酸來源少且價格昂貴，制約了對糖綴合物的合成研究。
　　 本論文主要分為兩部分研究內(nèi)容，第一部分是一鍋法合成多種糖核苷酸（第二章），作為糖基轉(zhuǎn)移酶合成糖綴合物的糖基供體;第二部分研究了擬南芥來源的UDP-糖焦磷酸化酶AtUSP對不同核苷三磷酸的識別與利用情況，測定了AtUSP對UTP、dUTP和dT

3、TP的動力學(xué)參數(shù)，并小規(guī)模制備了dUDP-Glc和dTDP-Glc。
　　 在糖核苷酸的體外合成中，最為簡便的方法是利用補救合成途徑進(jìn)行，補救合成途徑中，單糖分子首先需要進(jìn)行1位的磷酸化，然后在焦磷酸化酶或尿苷轉(zhuǎn)移酶作用催化下合成糖核苷酸。第二章中我們從擬南芥總cDNA中克隆得到了UDP-糖焦磷酸化酶的基因(AtUSP)，對基因進(jìn)行重組表達(dá)得到體外具有活性的AtUSP，結(jié)合本實驗室之前報道的來自肺炎鏈球菌的半乳糖激酶(SpGal

4、K)以及商品化的酵母菌焦磷酸酶(PPase)，以一鍋法的方式合成糖核苷酸o SpGalK和AtUSP都有較廣的底物適應(yīng)性，對經(jīng)過化學(xué)修飾的天然單糖可能有一定的催化能力，一鍋法中，我們從天然單糖或結(jié)構(gòu)經(jīng)過化學(xué)修飾的8種單糖分子出發(fā)，成功合成了5種相應(yīng)的UDP-糖，其中UDP-Gal和UDP-4-N3-Gal產(chǎn)率較高分別達(dá)到95％和43％，UDP-Glc和UDP-Fuc產(chǎn)率較低都在30％以下，分別為23％和29％，UDP-2-N3-Gal產(chǎn)

5、率最低只在MS中檢測到了產(chǎn)物的生成。在化學(xué)反應(yīng)中，疊氮基團屬于反應(yīng)活性基團，一鍋法中我們以較高的產(chǎn)率獲得了4位疊氮化的UDP-Gal，為化學(xué)法衍生其它C-4位修飾的UDP-Gal提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。與肺炎鏈球菌的UTP-Glc尿苷轉(zhuǎn)移酶(SpGalU)相比，AtUSP對C-4位修飾的Gal-1-P具有較大的容忍力，因此更適合于合成4位修飾的UDP-Gal衍生物。
　　 本文第三章主要進(jìn)行了AtUSP對不同核苷三磷酸的識別與利用能力的

6、研究，測試的9種核苷三磷酸中，5種為嘧啶型核苷三磷酸(UTP、dUTP、dTTP、CTP和dCTP)，4種為嘌呤型核苷三磷酸（ATP、dm6ATP、GTP和dGTP），其中只有UTP、dUTP和dTTP可以被AtUSP催化，UTP利用率最高達(dá)到97％，dUTP和dTTP次之，分別為85％和84％，對其它5種核苷三磷酸均沒有反應(yīng)，分析其原因可能與氫鍵的形成有關(guān)，UTP、dUTP和dTTP的嘧啶環(huán)上的C-4位上存在O原子，該處O原子可以與蛋

7、白形成氫鍵，促進(jìn)酶與核苷三磷酸的結(jié)合，而CTP和dCTP該處的O原子被氨基基團代替無法與酶的相關(guān)氨基酸形成氫鍵，導(dǎo)致AtUSP無法識別，其它四種核苷三磷酸堿基部分不僅無法形成氫鍵而且結(jié)構(gòu)龐大空間位阻大，影響了酶的識別;核苷三磷酸中核糖部分的C-2’位上的羥基雖然也可能參與氫鍵的形成，但并不影響酶的識別，只是稍微降低了酶對該核苷三磷酸的利用能力。動力學(xué)參數(shù)測定顯示AtUSP對UTP的Vmax、 kcat和Kcat/Km都遠(yuǎn)大于dUTP和d