關(guān)木通在龍膽瀉肝湯中配伍的腎毒性研究.pdf

1、龍膽瀉肝湯(《醫(yī)方集解》)由龍膽草、黃芩、梔子、澤瀉、木通、車前子、生地、當(dāng)歸、柴胡、甘草諸藥組成，可瀉肝膽實(shí)火，清肝膽濕熱，具有瀉肝而不傷肝，利濕而不傷陰的特點(diǎn)，湯劑和丸劑是其臨床運(yùn)用的主要形式，被廣泛用于臨床。然而近年國內(nèi)出現(xiàn)多例因服用龍膽瀉肝丸導(dǎo)致腎損害的臨床報(bào)道，這些報(bào)道在醫(yī)務(wù)界乃至全社會引起極大反響，因此，有關(guān)龍膽瀉肝丸/湯腎毒性的研究就成為國內(nèi)外共同關(guān)注的問題。 根據(jù)《中國藥典》(2000年版)規(guī)定，龍膽瀉肝丸/湯方

2、中的木通可為關(guān)木通，由于關(guān)木通為馬兜鈴科中藥，具有腎毒性，因此對于該方的腎毒性多責(zé)之為方中關(guān)木通使用。然而以中藥中的單一成分，或以方中含有毒性成分的藥味作為藥物或復(fù)方毒性評價(jià)依據(jù)不僅不符合中醫(yī)長期運(yùn)用中藥的經(jīng)驗(yàn)實(shí)際，而且與目前有關(guān)中藥毒理實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果不相吻合。 本課題通過研究龍膽瀉肝湯的毒性和研究方中關(guān)木通配伍與全方毒性的關(guān)系，闡明龍膽瀉肝湯可能的腎毒性機(jī)制，為該方的臨床合理使用提供安全性指導(dǎo)，以及為推進(jìn)中藥復(fù)方的毒副作用研究

3、提供研究示范。 論文分為文獻(xiàn)綜述和實(shí)驗(yàn)研究兩部分。文獻(xiàn)綜述部分主要對關(guān)木通的本草、臨床和實(shí)驗(yàn)的腎毒性研究進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)綜述。實(shí)驗(yàn)研究部分主要從龍膽瀉肝湯的劑量-時(shí)程-腎毒性關(guān)系、龍膽瀉肝湯與關(guān)木通的配伍-腎毒性關(guān)系、關(guān)木通及其龍膽瀉肝湯腎毒性機(jī)制不同層面上進(jìn)行了探討。 研究一.龍膽瀉肝湯中配伍關(guān)木通的劑量、時(shí)程與腎毒性的關(guān)系 實(shí)驗(yàn)1.常規(guī)劑量龍膽瀉肝湯的腎毒性初步觀察 方法：將大鼠隨機(jī)分為2組，龍膽瀉肝湯

4、組32只，正常對照組8只。按60kg成人等效劑量計(jì)算，龍膽瀉肝湯組大鼠以13g·kg-1(處方參照《方劑學(xué)》五版教材所載，其中含關(guān)木通1.5g·kg-1)的劑量予以龍膽瀉肝湯水煎劑，正常對照組予以等量蒸餾水，連續(xù)灌胃8周。分別于給藥第2、4、6、8周測定大鼠腎功能指標(biāo)，觀察腎臟組織形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果：該劑量條件下的龍膽瀉肝湯連續(xù)用藥8周，未見腎功能明顯損傷；病理組織學(xué)觀察顯示該劑量條件下的龍膽瀉肝湯連續(xù)用藥4周，大鼠腎臟無明顯病變，連續(xù)用

5、藥6周后僅見大鼠腎小管上皮輕度水腫現(xiàn)象，連續(xù)用藥8周后除大鼠腎臟的部分近曲小管上皮細(xì)胞界限不清，有空泡樣變性現(xiàn)象以外，未觀察到其他明顯病變，結(jié)論：常規(guī)劑量的龍膽瀉肝湯在短期內(nèi)應(yīng)用是相對安全的，但病理組織學(xué)觀察結(jié)果仍提示有一定的腎毒性趨向，若延長用藥時(shí)間或加大用藥劑量可能會造成腎臟的毒性損傷。 實(shí)驗(yàn)2.配伍不同劑量關(guān)木通的龍膽瀉肝湯腎毒性觀察 方法：大鼠隨機(jī)分為龍膽瀉肝湯含小劑量關(guān)木通組、龍膽瀉肝湯含中劑量關(guān)木通組、龍膽瀉

6、肝湯含大劑量關(guān)木通組和正常對照組四組，每組10只，用配伍不同劑量關(guān)木通的龍膽瀉肝湯水煎劑按原藥材每天13g·kg-1、14.5g·kg-1、17.5g·kg-1劑量(其中含關(guān)木通分別為1.5g·kg-1、3g·kg-1、6g·kg-1)給大鼠灌胃，對照組給予等量蒸餾水，連續(xù)12周，分別于給藥第4、8、12周測定大鼠腎功能指標(biāo)，觀察腎臟組織形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果：龍膽瀉肝湯中配伍小劑量關(guān)木通(1.5g·kg-1)連續(xù)用藥12周，未見大鼠腎功能明

7、顯損傷；配伍中劑量關(guān)木通(3g·kg-1)連續(xù)用藥12周，大鼠腎近曲小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)輕微損害；大劑量的關(guān)木通(6g·kg-1)連續(xù)用藥4周，大鼠即出現(xiàn)明顯的腎損傷，且隨著給藥時(shí)間的延長，損傷程度逐漸加重；病理觀察到腎損傷的部位主要是皮髓交界處的近曲腎小管。結(jié)論：龍膽瀉肝湯的腎毒性與其關(guān)木通配伍用量和服藥時(shí)間相關(guān)。龍膽瀉肝湯中配伍小劑量關(guān)木通在較短時(shí)間內(nèi)具有相對安全性，而配伍大劑量關(guān)木通可引起腎臟的損害。 研究二.不同配伍的龍膽瀉

8、肝湯的腎毒性研究 實(shí)驗(yàn)1.龍膽瀉肝湯腎毒性與關(guān)木通配伍關(guān)系的研究 方法：大鼠隨機(jī)分為含關(guān)木通的龍膽瀉肝湯組、龍膽瀉肝湯去關(guān)木通組、單味關(guān)木通組和正常對照組四組，每組10只，前三組分別按每日17.5g·kg-1、11.5g·kg-1、6g·kg-1(分別含關(guān)木通6g·kg-1、0g·kg-1、6g·kg-1)給以相應(yīng)方藥水煎液灌胃，對照組給予等量蒸餾水，連續(xù)12周。于給藥第4、8、12周分別測定各組大鼠腎功能及尿生化指標(biāo)。

9、結(jié)果：單味關(guān)木通(6g·kg-1)和含相同劑量關(guān)木通的龍膽瀉肝湯連續(xù)給大鼠灌胃12周，均見有腎損傷表現(xiàn)，其中龍膽瀉肝湯組損傷較單味關(guān)木通組輕；去關(guān)木通的龍膽瀉肝湯連續(xù)給大鼠灌胃12周，未見腎功能明顯損傷。結(jié)論：龍膽瀉肝湯與所配伍實(shí)驗(yàn)劑量的關(guān)木通可引起腎損傷，龍膽瀉肝湯的腎毒性與方中關(guān)木通的配伍相關(guān)，復(fù)方配伍對關(guān)木通的腎損傷可能有一定的減毒的作用。 實(shí)驗(yàn)2.龍膽瀉肝湯腎毒性與當(dāng)歸、生地和甘草配伍關(guān)系的研究 方法：大鼠隨機(jī)分

10、為單味關(guān)木通組、龍膽瀉肝湯組和龍膽瀉肝湯去歸地草方組、正常對照組，前三組分別按6g·kg-1、17.5g·kg-1(其中含關(guān)木通6g·kg-1)、14.5g·kg-1(其中含關(guān)木通6g·kg-1)給以相應(yīng)方藥水煎液灌胃，正常對照組給予等量蒸餾水，連續(xù)8周。給藥結(jié)束后，測定大鼠血、尿生化指標(biāo)，觀察腎臟組織形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果：三種方藥水煎液連續(xù)給大鼠灌胃8周，均見有明顯腎損傷表現(xiàn)，其中單味關(guān)木通組損傷最為嚴(yán)重；龍膽瀉肝湯組損傷較輕；去歸地草的

11、龍膽瀉肝湯組較龍膽瀉肝湯組損傷嚴(yán)重，個(gè)別指標(biāo)甚至高于單味關(guān)木通組。結(jié)論：實(shí)驗(yàn)劑量的關(guān)木通與配伍關(guān)木通的兩個(gè)復(fù)方均可引起腎損傷，龍膽瀉肝湯去當(dāng)歸、生地和甘草方的腎毒性較龍膽瀉肝湯強(qiáng)。提示含關(guān)木通配伍的復(fù)方的毒性作用不等于關(guān)木通，龍膽瀉肝湯方中當(dāng)歸、生地、甘草的配伍對關(guān)木通有一定的減毒作用。 研究三.不同配伍的龍膽瀉肝湯腎毒性機(jī)制的研究 實(shí)驗(yàn)1.不同配伍的龍膽瀉肝湯導(dǎo)致腎間質(zhì)炎癥的機(jī)制 方法：大鼠隨機(jī)分為單味關(guān)木通組

12、、龍膽瀉肝湯組和龍膽瀉肝湯去歸地草方組、正常對照組，前三組分別按6g·kg-1、17.5g·kg-1(其中含關(guān)木通6g·kg-1)、14.5g·kg-1(其中含關(guān)木通6g·kg-1)給以相應(yīng)方藥水煎液灌胃，正常對照組給予等量蒸餾水，連續(xù)8周。測定大鼠腎臟組織勻漿中IL-1β、IL-6水平，用免疫組化染色方法觀察大鼠腎組織NF-κBp65的表達(dá)。結(jié)果：單味關(guān)木通組、龍膽瀉肝湯組和龍膽瀉肝湯去歸地草方組大鼠的腎臟組織勻漿中IL-1β、IL-

13、6水平比正常對照組均有不同程度的升高，龍膽瀉肝湯組大鼠腎臟中的IL-1β與IL-6水平最低，而去歸地草的龍膽瀉肝湯組腎臟中的IL-1β與IL-6水平均高于龍膽瀉肝湯組，且IL-6水平還高于單味關(guān)木通組；腎臟的NF-κBp65的表達(dá)均較正常對照組有不同程度的升高，表達(dá)的部位主要集中在大鼠腎小管上皮細(xì)胞，單味關(guān)木通組大鼠腎小管上皮細(xì)胞的NF-κBp65表達(dá)的程度最高，去歸地草的龍膽瀉肝湯組表達(dá)程度次之，龍膽瀉肝湯組的表達(dá)程度最低，龍膽瀉肝湯

14、組與去歸地草的龍膽瀉肝湯組差異不顯著。結(jié)論：實(shí)驗(yàn)劑量的關(guān)木通與配伍關(guān)木通的兩個(gè)復(fù)方均可引起腎損傷，腎損傷以炎癥細(xì)胞浸潤為主的腎小管間質(zhì)病變和高水平的IL-1β與IL-6為特征，而NF-κBp65的活化可能參與小管-間質(zhì)的病理損害過程，推測關(guān)木通及其兩復(fù)方引起的腎毒性涉及免疫誘導(dǎo)的炎性損傷機(jī)制；當(dāng)歸、生地和甘草是龍膽瀉肝湯中可能的減毒配伍，其產(chǎn)生的減毒效應(yīng)與抑制腎臟中的IL-1β與IL-6水平升高，抑制在腎臟的免疫應(yīng)答有關(guān)；但這三味藥并不

15、是抑制NF-κBp65表達(dá)的主要成分，提示復(fù)方中的其他藥物也有可能存在一定的減毒作用，還需深入研究。 實(shí)驗(yàn)2.不同配伍的龍膽瀉肝湯導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的機(jī)制 方法：大鼠隨機(jī)分為單味關(guān)木通組、龍膽瀉肝湯組和龍膽瀉肝湯去歸地草方組、正常對照組，前三組分別按6g·kg-1、17.5g·kg-1(其中含關(guān)木通6g·kg-1)、14.5g·kg-1(其中含關(guān)木通6g·kg-1)給以相應(yīng)方藥水煎液灌胃，正常對照組給予等量蒸餾水，連續(xù)8周

16、。測定大鼠血漿及腎臟組織勻漿中Ang-Ⅱ水平，用免疫組化染色方法與原位雜交方法觀察大鼠腎組織TGFβ1mRNA與TGFβ1的表達(dá)。 結(jié)論：三種湯藥可使腎臟Ang-Ⅱ含量增加，并可進(jìn)一步上調(diào)小管上皮細(xì)胞的TGFβ1mRNA，使TGFβ1的表達(dá)升高，促進(jìn)TGFβ1的生物活性，最終導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生；大鼠腎臟的Ang-Ⅱ含量并不是決定各組之間TGFβ1mRNA和TGFβ1表達(dá)差異的主要因素。 本課題通過觀察配伍不同劑量關(guān)木

17、通的龍膽瀉肝湯在不同時(shí)間點(diǎn)的腎毒性情況，明確了龍膽瀉肝湯的腎毒性及不同劑量關(guān)木通配伍與全方腎毒性的關(guān)系；通過拆方研究，觀察到龍膽瀉肝湯的腎毒性與方中關(guān)木通配伍密切相關(guān)，其腎毒性作用較單味關(guān)木通小，復(fù)方中佐制藥味(當(dāng)歸、生地和甘草)的配伍對關(guān)木通腎損傷可能有一定的減毒作用；有關(guān)腎毒性機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)關(guān)木通及含關(guān)木通的龍膽瀉肝湯腎毒性涉及到炎性損傷和纖維化病理，與NF-κBp65、TGFβ1和Ang-Ⅱ等因子的上游調(diào)控有關(guān)。 本課題為