犬細(xì)小病毒流行病學(xué)調(diào)查及其感染F81細(xì)胞的比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析.pdf

1、犬細(xì)小病毒（Canine Parvovirus，CPV）是最常見(jiàn)的犬的致死性病毒之一。CPV在世界范圍內(nèi)流行，變異率很高，但是該病沒(méi)有有效治療方法，主要通過(guò)疫苗免疫進(jìn)行預(yù)防。為了監(jiān)測(cè)我國(guó)東北部地區(qū)的CPV變異情況，更好的預(yù)防CPV感染，從哈爾濱、長(zhǎng)春、沈陽(yáng)、保定、青島收集216份臨床病料，測(cè)序獲得64株VP2全長(zhǎng)序列，包含40株CPV-2a型，23株CPV-2b型和1株CPV-2c型毒株。調(diào)查結(jié)果顯示，保定地區(qū)主要流行CPV-2b型毒株

2、，其它4個(gè)地區(qū)主要流行CPV-2a型毒株，CPV-2c型首次在青島地區(qū)得到檢測(cè)。突變位點(diǎn)分析表明，本實(shí)驗(yàn)中100％的毒株序列在297和324位氨基酸殘基分別發(fā)生Ser-Ala和Ile-Arg的突變。我們檢測(cè)到5株病毒存在Gln370Arg突變，以往這種突變僅在熊貓的CPV分離株中發(fā)現(xiàn)，該突變可能會(huì)影響CPV的宿主范圍。選擇壓力預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)突變Phe267Tyr，Ser297Ala，Thr324Ile和Thr440Ala均在正向選擇壓力下。M

3、L進(jìn)化樹(shù)顯示，中國(guó)與其他國(guó)家流行的CPV-2c型毒株存在顯著地域差異。MCC樹(shù)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，東北部地區(qū)當(dāng)前流行的64個(gè)毒株都在同一進(jìn)化分支上，它們最近的共同祖先出現(xiàn)在1996年。值得注意的是，這次流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)以 CPV-HLJ-6為代表18株 CPV-2a序列完全一致，表明該毒株為東北部地區(qū)的優(yōu)勢(shì)流行毒株，我們推測(cè)當(dāng)前使用的疫苗不能對(duì)該優(yōu)勢(shì)毒株產(chǎn)生足夠的免疫效力。
　　為了揭示CPV流行毒株與疫苗毒株之間的差異，我們利用iTRAQ

4、結(jié)合納米高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，在優(yōu)勢(shì)流行毒株CPV-HLJ-6和CPV-2型弱毒疫苗毒株感染F81細(xì)胞后48 h進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析。鑒定到31個(gè)差異表達(dá)蛋白，利用David和Panther功能富集分析發(fā)現(xiàn)，差異蛋白涉及31個(gè)生物學(xué)過(guò)程，富集于14個(gè)細(xì)胞組分，分類于9個(gè)分子功能。利用MetaCore進(jìn)行通路富集分析發(fā)現(xiàn)，差異蛋白顯著富集于血凝、細(xì)胞骨架重塑和G蛋白信號(hào)相關(guān)信號(hào)通路。Ras超家族蛋白質(zhì)、細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白質(zhì)以及血凝現(xiàn)象

5、相關(guān)蛋白的發(fā)現(xiàn)，有助于從宿主細(xì)胞對(duì)病毒復(fù)制的影響、細(xì)胞致病性、病毒血凝性等方面揭示流行毒株與疫苗毒株之間的差異。
　　CPV流行毒株與疫苗毒株感染細(xì)胞的蛋白種類及表達(dá)量差異可能是毒株不同導(dǎo)致的，也可能是細(xì)胞處于不同感染階段所致。為了在感染后各個(gè)階段解析CPV與宿主相互作用關(guān)系，我們對(duì)CPV感染F81細(xì)胞后的5個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行了比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析。通過(guò)方差分析，篩選到感染后0-60 h存在615個(gè)差異蛋白質(zhì)，通過(guò)雙尾未配對(duì)t檢驗(yàn)，分別篩

6、選到85、102、95、209和225個(gè)細(xì)胞蛋白質(zhì)的表達(dá)量在CPV感染12 h、24 h、36 h、48 h和60 h有顯著差異。韋恩分析發(fā)現(xiàn)僅有3個(gè)差異蛋白質(zhì)共同存在于5個(gè)時(shí)間點(diǎn)。David功能富集發(fā)現(xiàn)，感染后12 h的差異蛋白主要富集于細(xì)胞周期相關(guān)生物學(xué)過(guò)程，在感染后60 h細(xì)胞凋亡相關(guān)差異蛋白種類最多。結(jié)合David及Cluster3.0分析，獲得了大量與細(xì)胞凋亡和病毒刺激相關(guān)的蛋白質(zhì)。通過(guò)通路富集分析發(fā)現(xiàn)8個(gè)與CFTR降解通路相